高危型人乳头瘤病毒感染与microRNA-155在宫颈鳞状细胞癌组织和血清中的表达及意义

陈瑞萍 麦振声 徐建平

微小RNAs(MicroRNA，miRNA)是一种广泛存在于真核生物中的内源性非编码RNA，它参与了机体的多种病理生理过程，比如细胞的分化、增殖及凋亡，甚至参与肿瘤的形成及发展[1]。其中miRNA-155被发现在多种实体肿瘤组织中表达升高[2]，因此，多数学者认为miRNA-155是一种致癌的miRNA。目前，已经明确高危型人乳头瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)的持续感染是宫颈鳞状细胞癌的直接原因，但HR-HPV是如何诱导宫颈鳞状细胞癌的发生仍不是十分清楚。本研究通过检测宫颈鳞状细胞癌患者HR-HPV的感染状态及宫颈鳞状细胞癌组织和血清中miRNA-155的表达，从而分析HR-HPV感染对miRNA-155在宫颈鳞状细胞癌组织及血清中表达的影响，并探讨其临床意义。

资料和方法

一、标本收集

收集在暨南大学附属第一医院妇科经病理诊断明确的宫颈鳞状细胞癌组织标本37例为研究组，标本获取前均未进行放疗、化疗以及其它治疗。依据2009年国际妇产科联盟(Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)宫颈癌的分期，研究组包括IA1期3例， IA2期5例， IB1期12例，ⅡA1期17例。研究组年龄39～61岁，平均年龄(50.3±7.4)岁。另选择同期因子宫肌瘤行全子宫切除的患者20例作为对照组，对照组年龄43～50岁，平均年龄(45.4±3.6)岁。对照组患者术前均行子宫颈细胞学检查排除子宫颈病变。所有标本均经术后病理检查证实，临床及病理资料完整。

二、主要方法

1.子宫颈脱落细胞收集及HPV检测

应用HPV采样刷于子宫颈口处采集子宫颈脱落细胞标本，将采样刷置入装有专用细胞保存液的取样管中，-20℃保存。采用导流杂交法检测HPV感染的基因型，实验过程严格按照试剂盒说明书操作(人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒购自凯普公司)。

2.子宫颈组织及血清标本收集

研究组通过宫颈锥切、广泛性全子宫切除后获取子宫颈组织标本，对照组通过子宫全切后获取子宫颈组织标本。全部的子宫颈组织标本用0.9%灭菌生理盐水冲洗3次后，将其置于2mL冻存管中，-80℃保存。全部研究对象在术前1天采集外周血3mL，分离血清后标本存于1.5mLEP管中，-80℃保存。

3.子宫颈组织和血清中RNA的提取

子宫颈组织及血清中RNA的提取采用RNA提取试剂盒(中国上海吉玛制药技术有限公司)，所有步骤严格按照试剂盒说明操作。全部RNA提取后在分光光度仪下确定总RNA的浓度及纯度，根据RNA浓度调整逆转录反应中RNA的用量。

4.逆转录反应

MiRNA-155茎环逆转录引物5’-GTCGCATTCGATGTTGTCCACTGTCTCTGATCCCTAGCGTCATCGAATGCGACACCCCT-3’，U6茎环逆转录引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，均由中国上海吉玛制药技术有限公司设计合成。逆转录反应采用20μL反应体系，反应条件为26 ℃ 30min，42 ℃ 3min， 85 ℃ 5 min。内参U6反应条件同上。逆转录后将cDNA产物立即取出快速置冰上冷却进行后续实验。其中miRNA-155逆转录产物用无RNA酶水稀释2倍。

5.实时荧光定量

PCR引物由中国上海吉玛制药技术有限公司设计合成，miRNA-155上游引物为：5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，下游引物为：5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG-3’，U6上游引物为:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物为:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3’。应用中国上海吉玛制药技术有限公司SYBER Green 实时荧光定量PCR试剂盒。反应采用20μL反应体系，反应条件为，95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s ；62 ℃ 50 s，共40个循环。内参U6反应条件同上。以生理盐水代替逆转录产物为阴性对照。设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。反应设两个复孔。

三、结果判断

以U6 snRNA为标准化内参，利用2-△△Ct法计算miR-155相对表达量。研究组中miRNA-155相对表达比值=2-△△Ct，

△△Ct=(CtmiRNA-155-CtU6)研究组-(CtmiRNA-155-CtU6)对照组。

四、统计学处理

运用SPSS13.0软件进行数据分析，经方差分析发现miRNA-155的相对表达量不满足正态分布和方差齐性条件，故以中位数( P25，P75) 表示。两组间HR-HPV阳性率比较采用χ2检验，两组间miRNA-155的相对表达量用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、两组HR-HPV检测

研究组HR-HPV感染率明显高于对照组，两组比较有统计学差异(χ2= 19.64，P<0.01),见表1。

二、两组宫颈组织与血清中miRNA-155的表达

研究组宫颈组织中miRNA-155的相对表达比值是对照组的2.64倍，差异有统计学意义(Z=-2.20，P<0.05)(图1)。研究组血清中miRNA-155的相对表达比值是对照组的12.73倍，差异有统计学意义(Z=-4.75，P<0.05)(图2)。对照组中1例HR-HPV阳性病例的miRNA-155相对表达量为0.27，对照组miRNA-155相对表达量中位数0.15(0.07～0.21)。

表1 研究组与对照组HR-HPV感染率比较

图1 研究组和对照组宫颈组织中miRNA-155的相对表达量

图3 研究组中HR-HPV阳性组与HR-HPV阴性组miRNA-155的相对表达量

三、研究组中HR-HPV阳性组和HR-HPV阴性组miRNA-155的表达

依据是否感染HR-HPV将研究组分为HR-HPV阳性组和HR-HPV阴性组进行组内比较。HR-HPV阳性组宫颈组织miRNA-155的相对表达比值是HR-HPV阴性组的3.75倍，差异有统计学意义(Z=-2.26，P<0.05)(图3)。

四、研究组HR-HPV阴性组和对照组中HR-HPV阴性组miRNA-155的表达

将研究组(11例)与对照组中HR-HPV阴性组(19例)进行组间比较，发现研究组HR-HPV阴性组宫颈组织miRNA-155的相对表达比值是对照组HR-HPV阴性组的2.72倍(图4)。

图4 研究组HR-HPV阴性组与对照组中HR-HPV阴性组miRNA-155的相对表达量

讨 论

宫颈鳞状细胞癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，死亡率位居妇科恶性肿瘤的首位，严重威胁女性健康。研究表明，HR-HPV的持续感染是导致宫颈癌发生的一个关键因素[3]。本研究发现，研究组中HR-HPV感染率明显高于对照组(P<0.05)，这与已有研究一致。然而，宫颈癌的发生与发展是一个多因素多环节的过程。miRNA是一种广泛存在于真核生物中的内源非编码RNA。成熟miRNA由19-25个核苷酸组成。它通过碱基互补配对原则与目标miRNA相结合，从而起到转录后抑制的作用[1]。miRNA参与了机体多种病理生理过程，包括细胞生长，分化，细胞凋亡甚至肿瘤的形成及发展。Ovcharenko等[4]研究显示，miRNA-155是一种凋亡抑制基因，其作用机制可能是通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性从而发挥抗凋亡的作用。在肺癌，乳腺癌，胃癌等多种实体肿瘤组织中都能发现miRNA-155表达升高[2]。因此，miRNA-155被认为是一种致癌的miRNA。本研究发现，在宫颈鳞状细胞癌组织中HPV阴性组miRNA-155的相对表达比值是正常宫颈组织(对照组HR-HPV阴性)的2.72倍，两组相比有显著性差异(P<0.05)。根据Ovcharenko的研究，miRNA-155表达上调可能抑制caspase-3的活性，使得凋亡减少，从而在宫颈鳞状细胞癌的发生发展中发挥作用。此外，本研究还发现在宫颈鳞状细胞癌HR-HPV阳性组宫颈组织中miRNA-155的相对表达比值是宫颈鳞状细胞癌HR-HPV阴性组的3.75倍，提示宫颈组织感染HR-HPV与miRNA-155的表达相关。研究表明[5]，HPV感染机体后，可整合到机体细胞基因组中，其脆性位点往往是HPV整合到细胞基因组的理想位置，HPV基因整合到脆性位点后，可能影响其附近的miRNA的表达。据此我们认为，当HR-HPV持续感染宫颈上皮细胞，其中一部分HR-HPV可能整合到宿主细胞的基因组中，可导致miRNA-155的表达发生变化，而miRNA-155作为一种致癌的miRNA，可使宫颈上皮细胞的增殖周期失调，出现凋亡减少，从而参与宫颈鳞状细胞癌的发生发展。

目前，鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)被认为是宫颈鳞状细胞癌最常用的标志物，但在食道癌，肺癌等鳞状细胞肿瘤、甚至在皮肤病，呼吸系统疾病等非肿瘤疾病中，同样能发现其表达升高[6]。故SCCA在临床中应用的价值有限。随着检测技术的进步，发现miRNA在血清中具有相当高的稳定性[7]，而本研究中宫颈鳞状细胞癌患者血清中miRNA-155表达较对照组明显升高(p<0.05)，它能够稳定地被检测并且能提示肿瘤的状态，因此，血清中miRNA-155的检测为下一步寻找宫颈鳞状细胞癌标志物打下了基础。

[1]Harfe BD.MicroRNAs in vertebrate development [J].Curr Opin Genet Dev, 2005, 15(4):410-415.

[2]Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets [J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(7):2257-2261.

[3]Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J , et al .Human papillomavirus and cervical cancer [J].Lancet,2007，370(9590):890-907.

[4]Ovcharenko D, Kelnar K, Johnson C, et al.Genome-scale microRNA and small interfering RNA screens identify small RNA modulators of TRAIL-induced apoptosis pathway [J].Cancer Res,2007 ,67(22):10782-10788.

[5]Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(9):2999-3004.

[6]Erickson JA, Lu J, Smith JJ, et al.Immunoassay for quantifying squamous cell carcinoma antigen in serum [J].Clin Chem,2010, 56(9):1496-1499.

[7]Kosaka N, Iguchi H, Ochiya T, et al.Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis [J].Cancer Sci, 2010,101(10):2087-2092.