连香树精油对植物病原真菌抑菌作用及对人肝癌细胞株SMMC－7721细胞毒性研究

汪 超，唐 明，魏 琴，马丹炜，王亚男，张 红，李 群*

连香树精油对植物病原真菌抑菌作用及对人肝癌细胞株SMMC－7721细胞毒性研究

汪 超1，唐 明1，魏 琴2，马丹炜1，王亚男1，张 红1，李 群1*

(1．四川师范大学生命科学学院，四川成都610101; 2．宜宾学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000)

首次以连香树精油作为天然抑菌剂及抑癌剂，检测连香树精油对6种植物病原真菌的抑菌作用及对人肝癌细胞株SMMC－7721的细胞毒性，旨在探究连香树精油在抑菌和抑癌方面的功能，为天然抗菌剂和抗癌药物的开发打下基础．采用改良琼脂稀释法测定连香树精油对6种植物病原真菌的抑制率、最低抑菌体积分数(MIC)和最小杀菌体积分数(MBC)，并采用MTT法检测其对人体肝癌细胞SMMC－7721的细胞毒性．结果表明，连香树精油具有较好的抗菌性和抗癌性．在抗菌方面，对玉米大斑、黑曲霉以及根霉的抑菌效果较好，抑制率分别达到97．8%、99．7%、99．4%;对禾谷镰孢菌的抑菌效果较差(最高抑制率仅为29．1%)．在MIC和MBC测定实验中，同样表明连香树精油对黑曲霉的抑菌效果较好(MIC为6．25 μL/mL，MBC为50 μL/mL)．在抑癌方面，连香树精油对SMMC－7721肝癌细胞具有较好的抑制效果，当精油体积分数为8 μL/mL时，对SMMC－7721肝癌细胞的抑制率可以达到67．9%，与阳性对照5－氟尿嘧啶(抑制率68．9%)没有显著差异，且对正常肝细胞L02的杀伤作用(抑制率18．7%)要远远低于5－氟尿嘧啶对其伤害(抑制率59%)．连香树精油对植物病原真菌和SMMC－7721肝癌细胞具有良好的抑制作用，在农药及医药应用中有较好的应用潜力．

连香树精油;天然抗菌剂;天然抗癌剂;植物病原真菌;SMMC－7721肝癌细胞

连香树 (Cercidiphyllum japonicum Sieb．et Zucc．)属连香树科连香树属，别名五君树、山白果，为我国首例的二级保护植物，其味芳香，百米可闻，因其大树越摇越香而得名［1］．目前关于连香树的研究，主要集中在食品、化工、育苗及观赏价值等方面［2］．连香树的化学成分分析及生物活性方面的研究少见报道，特别是产生香味的化学成分——连香树精油的研究还是空白．

众所周知，植物病原菌危害是粮食产量降低的主要原因之一［3］．目前在农业生产中主要采用一些化学农药对植物病原菌进行防治，但化学农药具有高毒、容易富集、污染大等缺点［4］．另外，癌症的治疗已成为世界性难题之一，目前治疗的手段主要包括放疗、化疗等一些对人体伤害较大的方式．多年来，研究者们一直在寻求天然杀菌剂和天然抗癌药物，其中植物精油作为植物活性成分的重要组成部分，研究表明它具有良好的抑菌性［5］、抗癌性［6］、杀虫作用［7］以及保鲜作用［8］，同时具有毒性较低、污染小等优点［9］，因此，近年来以植物精油代替化学药物抑制植物病原菌和各种癌细胞的报道已逐渐增多．

该文首次以连香树精油这种天然活性物处理6种植物病原真菌和人体肝癌细胞，探究其抑菌能力和抑癌能力，进而评估其作为天然抑菌和抑癌药物的可能性，旨在为连香树精油的开发和利用奠定基础．

1 材料与方法

1．1 材料 连香树精油，由宜宾学院香料植物开发与利用四川省高校重点实验室提供;6种供试植物病原真菌分别为玉米大斑(Exserohilum turcicum，ET)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici，PC)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，FG)、黑曲霉(Aspergillus

Niger，AN)、根霉(Rhizopus，RP)、假丝酵母(Candida Albicans，CA)，均由本实验室提供，均采用PDA培养基进行培养保存;人肝癌细胞株SMMC－7721由本实验室提供，采用RPMI1640培养基进行培养．

1．2 仪器 全波长紫外分光光度计购自MSS型成都军能海尔思科技有限公司;二氧化碳培养箱，购自赛默Thermo 311成都军能海尔思科技有限公司;倒置显微镜，购自XD－30宁波舜宇仪器有限公司．

1．3 方法

1．3．1 抑菌圈测定 用改良的琼脂稀释法对连香树植物精油的抑菌活性进行定性分析．参照马萱等［10］的方法，略作改动．用丙酮将连香树精油稀释成12．5～200 μL/mL，经0．22 μm滤膜过滤除菌，各吸取1～25 mL冷却至37℃左右的PDA培养基中，摇匀后倒入无菌的平板中冷却，作为药用培养基，以加等体积丙酮的PDA培养基为对照．在超净工作台上，用接种针分别挑取适量的6种植物病原真菌孢子，置于PDA平板上划线，放置28℃恒温培养箱中培养7 d后，加入适量的无菌水冲洗平板，获得孢子悬浮液，并用无菌水调整孢子悬浮液约为5×104个/mL．吸取200 μL孢子悬浮液至新的PDA平板上，涂布均匀后置于28℃恒温培养箱中培养7 d后，用直径为6 mm的无菌打孔器，分别对其进行打孔，获得菌饼．将其分别接种到不同体积分数的药用培养基和对照培养基上，置28℃恒温培养箱中培养5 d后，用相交垂直线法测定菌落直径，3次平行，2个重复．抑制率(%)=(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－6 mm)×100%．

1．3．2 最低抑菌体积分数(MIC)和最小杀菌体积分数(MBC)测定 采用二倍稀释法测定连香树精油的最小抑菌体积分数(MIC)和最小杀菌体积分数(MBC)，对其抑菌活性进行定量分析．用丙酮将精油稀释至6．25～400 μL/mL，经0．22 μm滤膜过滤除菌，各吸取1～25 mL冷却至37℃左右的PDA培养基中，配制成药用培养基(丙酮为对照);将各病原菌制备成孢子悬浮液(106～107个/mL)，分别吸取200 μL涂布于药用培养基和对照培养基上，28℃培养5～7 d，以无菌生长时的连香树精油的体积分数为最低抑制体积分数(MIC)［11］;然后用无菌水清洗未长菌的药用培养基，吸取200 μL加到空白的PDA培养基中培养5～7 d，以无菌生长时的连香树精油体积分数为最小杀菌体积分数(MBC)［11］．

1．3．3 细胞毒性检测 采用MTT法［12］检测连香树精油对人肝癌细胞株SMMC－7721细胞增殖抑制作用．人肝癌细胞株SMMC－7721和正常肝细胞L02用RPMI1640完全培养液(含10%小牛血清，1%青霉素，1%链霉素)在37℃、含5%CO2恒温培养箱中培养．待其长到对数生长期时，用0．25%胰蛋白酶消化，调整细胞数为1×105个/mL，接种到96孔板中，每个孔加98 μL继续培养24 h．细胞贴壁后，加入2 μL不同体积分数的连香树精油，使其体积分数分别为0．25，0．5，1．0，2．0，4．0和8．0 μL/mL;以等体积5－氟尿嘧啶(8 mg/mL)为阳性对照，等体积丙酮为阴性对照．培养24 h后，用倒置显微镜(10×20倍)观察各处理梯度的细胞形态变化，并随机各取10个视野统计细胞数目，计算每个视野中细胞平均数，且进行显著性分析(P≤0．05)．之后，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT(PBS配制)，培养4 h后吸去上清，每孔加150 μL DMSO，在摇床上低速震荡10 min，充分溶解甲瓒．用全波长紫外分光光度计在490 nm处检测每孔OD值，计算细胞增殖抑制率，4次平行，2个重复．细胞增殖抑制率%=(阴性对照组平均OD值－处理组平均OD值)/阴性对照组平均OD值×100%．

1．3．4 数据统计及处理 实验所有的数据以SPSS 17．0处理分析获得，均以“平均值±标准误”来表示;数据显著性(P≤0．05)及极显著性(P≤0．01)均在Duncan检测下获得．

2 结果与分析

2．1 连香树精油对病原真菌抑制作用

2．1．1 不同体积分数的精油对菌体的抑制作用不同体积分数的连香树精油处理玉米大斑(Exserohilum turcicum，ET)、辣椒霉菌(Phytophthora capsici，PC)、禾谷镰刀孢菌(Fusarium graminearum，FG)、黑曲霉(Aspergillus nige，AN)、根霉(Rhizopus，RP)以及假丝酵母(Candida Albicans，CA)所获得的精油体积分数－菌体生长抑制率趋势图见图1;效果较好的玉米大斑、黑曲霉及根霉的培养基平板图见图2．由图1可知，对玉米大斑而言，随着精油体积分数(12．5～100 μL/mL)的增加，菌体生长抑制率逐渐增大，且各体积分数间呈极显著差异(P≤ 0．01)(见图2A);精油体积分数在100 μL/mL时，其菌体抑制率达到最大，最大值为97．8%(见图2A－5);精油体积分数在100～200 μL/mL之间时，随着精油体积分数的增加，抑制率反而降低，且各体积分数间差异显著(P≤0．05)．在对辣椒霉菌的研究中，随着精油体积分数的增加(12．5～200 μL/ mL)，菌体生长抑制率同样呈正相关增长趋势，且精油体积分数在200 μL/mL时，抑制率达到最大(85．7%)，各梯度间呈极显著差异(P≤0．05)．对于禾谷镰刀孢菌来说，精油体积分数在12．5～100 μL/mL之间时，精油体积分数－菌体生长抑制率呈正相关关系，且精油体积分数在100 μL/mL时其菌体抑制率达到最大，为29．1%，各梯度间具有极显著差异(P≤0．01)．精油对黑曲霉抑制效果的评估中，随着精油体积分数的增加(12．5～100 μL/ mL)，其菌体生长抑制率亦增加(见图2B)，且精油体积分数在100 μL/mL时，抑制率达到最大值，为99．7%(见图2B－5)，且各梯度间具有极显著差异(P≤0．01)．对于根霉(见图2C)而言，精油体积分数在12．5～100 μL/mL之间，精油体积分数－菌体生长抑制率呈正相关关系，精油体积分数100 μL/ mL时菌体抑制率达到最大值，为99．4%(见图2C)，且各梯度间呈极显著差异(P≤0．01)．在对假丝酵母的研究中，随着精油体积分数的增加(12．5～50 μL/mL)，菌体生长抑制率同样逐渐增大，且精油体积分数在50 μL/mL时，抑制率达到最大(43．8%)，相关性分析可知，各梯度间呈极显著差异(P≤0．01);精油体积分数在50～200 μL/mL时，随着精油体积分数的增加，其菌体抑制率逐渐减小，且各梯度间呈极显著差异(P≤0．01)．

以上结果表明，连香树精油对玉米大斑、黑曲霉以及根霉的抑菌效果较好，有待进一步研究其抑制机理．

根据不同体积分数连香树精油对6种受试植物病原真菌抑制率的差异性而做的毒力测定结果见表1．从表1可知，连香树精油对6种受试植物病原真菌的抑制效果随精油体积分数的增大呈现不同的模式．对玉米大斑、辣椒霉菌以及禾谷镰孢菌而言，随精油体积分数的变化抑菌效果成二次函数模式;而对黑曲霉、根霉和假丝酵母来说，随精油体积分数的变化抑菌效果呈非线性增长模式．

另外，从毒力回归方程可以看出，除禾谷镰孢菌无对应的EC50值外，其余5种受试植物病原菌均有各自对应的EC50值，说明连香树精油对禾谷镰孢菌抑制效果较差，对其他5种受试植物病原菌抑制效果较好．其中玉米大斑与辣椒疫霉EC50值分别为42．5和71．4 μL/mL，且相关系数(R2)接近1，表明其EC50值可靠性较高;而黑曲霉、根霉、假丝酵母的相关系数(R2)与1偏差较大，表明其EC50可靠性相对较低．

表1 连香树精油对6种植物病原真菌的毒力测定结果Table 1 Toxicity of the essential oil from Cercidiphyllum japonicum to 6 phytopathogenic fungi

2．1．2 MIC和MBC测定 不同体积分数的连香树精油处理6种植物病原真菌后，所获得的最低抑制体积分数(MIC)和最小杀菌体积分数(MBC)结果见表2．从表中明显可以看出，连香树精油对黑曲霉的抑杀作用最强，其MIC为6．25 μL/mL，MBC为50 μL/mL;对禾谷镰孢菌的抑杀作用最差(MIC和MBC分别为50和200 μL/mL);对其他4种受试植物病原菌的抑菌效果，则介于以上2种病原菌之间．以上结果与抑菌圈测定结果基本一致．

表2 连香树精油对6种植物病原真菌的抑菌活力Table 2 The antibacterial activity of Cercidiphyllum japonicum oil on 6 phytopathogenic fungi

2．2 连香树精油对肝癌细胞SMMC－7721的细胞毒性 不同体积分数连香树精油对 SMMC－7721肝癌细胞抑制活力见图3．从图中可以看出，精油体积分数为0．25 μL/mL时对SMMC－7721肝癌细胞的抑制作用表现为最低，抑制率为8．37%，与阴性对照丙酮的抑制率(8．23%)差异不大;随着精油体积分数的增大，精油对SMMC－7721肝癌细胞的杀伤能力也在逐渐增大，且各梯度之间具有显著性差异;当精油体积分数在8 μL/mL时对SMMC－7721肝癌细胞抑制作用最大，抑制率为67．9%，与阳性对照 5－氟尿嘧啶抑癌效果(抑制率68．9%)没有显著的差异．另一方面，精油在抑制肝癌细胞生长的同时，也对正常细胞产生一定的毒性．从图中可以看出，随着精油体积分数增大，精油对L02正常肝细胞有一定的毒害作用;在精油体积分数较低(0～0．5 μL/mL)时，毒害作用与阴性对照丙酮的抑制率(8．23%)相比差异不大;当精油体积分数(1～8 μL/mL)较高时，精油对肝细胞有一定的毒性，且差异较显著，当精油体积分数在8 μL/ mL时毒害作用达到最大(抑制率为18．7%)，但仍远远低于阳性对照5－氟尿嘧啶的毒害(抑制率为59%)．

在前面研究结果的基础上，进一步观察了8 μL/mL连香树精油处理SMMC－7721肝癌细胞后细胞形态的变化，结果见图4，并对细胞数目进行了统计，结果见表3．从图4与表3中可以看出，和对照细胞数量(320个)(图4A)相比，8 μL/mL连香树精油处理后的细胞数量(125个)(图4C)和5－ 氟尿嘧啶处理后的细胞数量(122个)(图4B)结果相当(P≤0．05)，但明显低于对照处理细胞数量，同时细胞形态也由对照时呈现的长梭状(图4A)逐渐改变为处理后球形(图4B和4C)．同样，用8 μL/ mL连香树精油处理L02正常细胞(图4F)和未做处理的正常L02细胞(图4D)相比，细胞数量分别为165个和206个，具有差异性(P≤0．05)，说明8 μL/mL连香树精油对L02细胞有一定的伤害作用;另外，比较5－氟尿嘧啶处理L02正常细胞(图4E)和未做处理的L02正常细胞(图4D)，发现5－氟尿嘧啶处理后细胞数量为76个，这远低于未做处理的L02对照细胞数量(206个)(图4D)与8 μL/mL连香树精油处理后的细胞数量(165个)(图4F)，且差异显著(P≤0．05)，说明5－氟尿嘧啶对正常L02细胞的伤害作用要远高于连香树精油．

表3 8μL/mL连香树精油处理SMMC－7721肝癌细胞和L02肝细胞其细胞数量的变化情况Table 3 The human carcinoma cells SMMC－7721 and human hepatic cells L02 of amount with treatment of 8 μL/mL Cercidiphyllum japonicum oil

依据上述不同体积分数的连香树精油处理SMMC－7721肝癌细胞测定的抑癌活力，分析其毒力回归方程为:y=7．362x+9．712(R2=0．990;其中，IC10为0．039 μL/mL，IC50为5．47 μL/mL，IC90为10．91 μL/mL)，表明连香树精油具有良好的抑癌活力，加之连香树精油对L02肝细胞的毒害作用较小，可以初步说明连香树精油具有开发成抑制肝癌药物的潜力．

3 结论与讨论

植物精油来源于天然，对人体相对安全，毒性低、易降解、对环境污染小，研发成本相对较低，作为一大类天然的杀菌剂和抑癌剂，越来越引起人们的关注［13－14］．目前，连香树精油是否有抑菌或抑癌作用，还未见报道．该研究以连香树精油处理6种不同的植物病原菌与SMMC－7721人体肝癌细胞，得到如下结果:在抑菌方面，连香树精油对6种受试菌均具有一定的抑制作用，尤其对玉米大斑(抑制率为97．8%)、黑曲霉(抑制率为99．7%)以及根霉(抑制率为99．4%)的抑制作用较强．这与张焱珍等［15］的研究结果有一定的差异．张焱珍等［15］以77种植物提取物作为天然抑菌剂处理不同的植物病原菌的研究中指出，龙舌兰提取物对玉米大斑病菌的抑制率为76．6%，这远低于本研究结果，可能是不同植物精油的化学成分不同，导致对同一种受试菌的抑菌效果存在差异性;同样，马萱等［10］在4种植物芳香精油(法国百里香、苏格兰薄荷、甜薰衣草和阔叶迷迭香)对黑曲霉抑菌作用的研究中指出，4种植物芳香精油对黑曲霉均具有抑制力，且法国百里香精油体积分数为12．5 μL/mL时，对黑曲霉的抑制率高达100%，这与本研究结果基本一致．李欣等［16］在杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究中也报道了杜仲雄花乙酸乙酯提取物对黑曲霉有着较好的抑制作用，但对根霉没有抑制作用．从以上较多的报道以及结合本研究结果可以得出，大多数植物精油对玉米大斑、黑曲霉、根霉都有一定的抑菌作用，连香树精油对这3种受试菌的抑制效果相对较强，均达97%以上，有进一步扩大应用的潜力．究竟连香树精油是怎样抑菌或抑菌机理是什么，有待进一步研究．

目前，植物精油抑菌机理的研究可以归纳为以下几个方面:1)损伤质膜，改变膜的物理参数和选择通透性，导致其孢子失去萌发力，并抑制菌丝体生长［17］．2)上调nox1基因的表达从而产生大量的抑制霉的活性氧(ROS)［18］．3)影响脂质层稳定，溶解胞体中的脂肪体及能量代谢及还原酶系［19］．因此，本研究中，连香树精油的抑菌机理是否是以上的某一方面或有另外的抑菌机理，还有待下一步的研究．在抑癌方面，首先，本研究得出连香树精油在体积分数较高(8 μL/mL)时，可以明显杀伤SMMC－7721肝癌细胞，且与阳性对照(5－氟尿嘧啶)杀伤癌细胞的差异不大．T．T．Zhang等［20］以悬钩子植物提取物作为抑癌剂处理肺癌细胞A549，发现200 μg/mL的悬钩子植物提取物抑癌效果最为明显，抑制率可以达到60%．这与本研究结果有一定的相似性，充分说明了很多植物精油均具有较强的抑癌效果．其次，本研究同样得出，连香树精油对正常细胞L02的毒杀能力较低，这与于冬梅［21］的研究结果具有一定的相似性．于冬梅等［21］在云南松松塔提取物对人肝癌细胞增殖的研究中，指出云南松松塔乙醇提取物(YN－DEF)具有良好抑制肝癌细胞增殖的作用，但对正常肝细胞L02的毒性较小．同样，张瑞晨等［22］在何首乌不同分离部位对人正常肝L02细胞和肝癌HepG2细胞杀伤作用的研究中指出，何首乌提取物对肝L02细胞杀伤作用较小．结合本研究可以说明，植物精油要比传统的化学药剂对正常细胞的杀伤作用要小得多，这无疑是将天然植物精油开发为抗癌剂的一大优势．

本研究以连香树精油作为天然抑菌剂及抑癌剂处理6种植物病原真菌和SMMC－7721肝癌细胞，结果表明连香树精油具有较高的抑菌性和抑癌性，为其进一步在抑菌、抑癌药物方面的应用和开发打下了基础．

致谢 四川师范大学实验技术与管理项目(SYJS2015－05)对本文给予了资助，谨致谢意．

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Evaluation of Antibacterial and Cytotoxic Activity of Cercidiphyllum japonicum Oil Against Phytopathogenic Fungi and Humanhepatocellular Carcinoma Cells SMMC-7721

WANG Chao1，TANG Ming1，WEI Qin2，MA Danwei1，WANG Yanan1，ZHANG Hong1，LI Qun1

(1．College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan; 2．Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education，Yibin College，Yibin 644000，Sichuan)

This is the first study to use Cercidiphyllum japonicum oil as natural antimicrobial agents and anticancer drugs．To detect the antibacterial activity of Cercidiphyllum japonicum oil on the 6 kinds of phytopathogenic fungis as well as the cytotoxic function against human carcinoma cells，SMMC-7721，this study explores the efficacy of Cercidiphyllum japonicum oil on antibacterial and antitumor properties and lays the foundation for the development of natural antimicrobial agents and anticancer drugs．Using the modified agar diffusion method，the inhibitory rate，the minimal inhibitory concentration(MIC)and the minimal bactericidal concentration(MBC) of concentration(MIC)against the 6 kinds of pathogenic fungi have been investigated．In order to detect the relevant cytotoxic effects on human carcinoma cells，SMMC-7721，the MTT method is used．The Cercidiphyllum japonicum oil has an incredible effect on the antimicrobial and anticancer properties．In terms of the antibacterial aspect of Setosphaeria，the Exserohilum turcicum，Aspergillus Niger and Rhizopus，had better inhibitory effects，with the inhibition rates reaching 97．8%，99．7%and 99．4%，respectively．However，the Fusarium graminearum showed a poorer effect(with the highest inhibition rate reaching only 29．1%)．The result from the experiment of the 6 kinds of pathogenic fungi with the method of MIC and MBC also shows that Cercidiphyllum japonicum oil performs well when dealing with Aspergillus Niger(MIC is 6．25 μL/mL，MBC is 50 μL/mL)．The Cercidiphyllum japonicum oil also has good inhibition effects on human carcinoma cells，SMMC-7721．When the concentration is 8 μL/mL，the inhibition rates can reach up to 67．9%．No significant differences have been found when it was compared to positive control 5-fluorouraci(inhibition rate 59%)．Cercidiphyllum japonicum oil has an excellent inhibitory effect on phytopathogenic fungi and human carcinoma cells，SMMC-7721，which indicates a high potential in the future，in the areas of pesticide and medicine．

Cercidiphyllum japonicum oil;natural antimicrobial agent;natural anticancer drugs;phytopatho-genic fungi;SMMC-7721 carcinoma cells

Q939．95

A

1001－8395(2016)05－0735－08

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．05．021

(编辑 李德华)

2015－09－06

四川省高校重点实验室开放基金(2015XLY006)

*通信作者简介:李 群(1971—)，女，副教授，主要从事植物细胞工程的研究，E－mail:Liqun01234@163．com