沙棘叶黄酮对小鼠急性肝损伤的保护作用

李淑珍，武 飞，杨 宁，陈月林

沙棘叶黄酮对小鼠急性肝损伤的保护作用

李淑珍1，武 飞2，杨 宁1，陈月林1

(1．乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古乌兰察布012000; 2．乌兰察布中心医院，内蒙古乌兰察布012000)

当今用于治疗肝脏疾病的药物，长期服药会给患者带来负作用，因此寻找新型、安全的天然植物源保肝活性物质具有重要意义．探讨沙棘叶黄酮对小鼠急性肝损伤的保护作用，为探索保肝药物提供实验基础．通过小鼠灌胃给药，用四氯化碳(CCl4)制备急性肝损伤模型，用比色法检测血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(AKP)活性和肝脏过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，计算肝指数和进行病理学显微切片观察．实验结果得出:沙棘叶黄酮中剂量组(100 mg/kg)可明显降低损伤小鼠血清AKP、GPT、GOT含量和肝脏MDA含量，提高肝脏POD、SOD活性．说明一定剂量的沙棘叶黄酮对小鼠急性肝损伤有保护作用，其机理可能与黄酮的抗脂质过氧化作用有关．

沙棘叶黄酮;肝损伤;小鼠模型;保肝作用

肝脏是人体最大的腺体．肝丰富的血供和独特的形态结构使其代谢极为活跃，不仅是机体重要的代谢器官，而且还具有分泌、排泄和解毒等重要功能．而今用于治疗肝脏疾病的药物，长期服用有时会给患者带来负作用，因此寻找新型安全的天然植物源保肝活性物质具有重要意义［1－5］．沙棘(Hippophe rhamnoids L．)为胡颓子科植物，其干燥成熟果实系蒙古族、藏族习用药材，作为传统中药自古以来就有广泛应用，1997年被列入中国药典治疗多种疾病［6］．沙棘果黄酮类化合物具有保肝作用［7］，据研究证明沙棘叶更富含黄酮类化合物，并且从叶中提取黄酮具有原料来源广泛，成本低廉的优势［8］．但对于沙棘叶的研究所见文献甚少，如能拓展对沙棘叶黄酮的研究，可以有效地促进内蒙古沙棘资源的综合利用．本文以沙棘叶作为材料，探讨叶黄酮的保肝作用，为保肝药物的探索提供实验基础，为内蒙古沙棘资源的合理利用提供理论依据．

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 沙棘叶黄酮精制品，总黄酮含量14．89%，由本实验室制备;在配制灌胃液前浓缩成总黄酮含量为68．12%的浓缩液．联苯双酯，浙江万邦药业股份有限公司(批号A02150803)．四氯化碳，上海长江化工厂生产，分析纯，用前配成0．1%大豆油溶液．谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所．

1．2 仪器 722分光光度计(上海电子光学技术研究所)，BECKMAN全自动生化分析仪．

1．3 动物分组与处理 昆明种雄性小鼠60只，体重(20±2)g，由内蒙古大学动物实验中心提供，合格证号:scxk(蒙)2002－0001．将小鼠随机分为6组，每组10只．分别是正常对照组、CCl4模型组、联苯双酯组、黄酮高、中、低剂量组，各组每天灌胃给药1次．正常对照组和CCl4模型组灌胃150 mg/kg的蒸馏水，联苯双酯组灌胃150 mg/kg的联苯双酯溶液，黄酮高、中、低剂量组灌胃剂量分别为150、100和50 mg/kg的沙棘叶黄酮溶液，连续7 d．末次给药后10 h，除正常对照组外，其他各组小鼠腹腔注射0．1%CCl4大豆油溶液10 mL/kg，同时禁食，自由饮水．16 h后眼球取血，分离血清，另取肝脏备检［9－10］．

1．4 指标测定［11－12］采用试剂盒测定血清GPT、

GOT和AKP．取肝脏称重，计算肝指数:肝指数= (肝脏重量/体重)×100%．取肝右叶用生理盐水冲洗后制备成10%的肝匀浆，测定POD、SOD、MDA．另取肝左叶，置10%中性缓冲甲醛溶液中，经脱水→透明→石蜡包埋→切片→脱蜡→HE染色后，在400倍光镜下观察肝细胞的病理形态学变化，由乌兰察布中心医院病理检验室完成．

1．5 统计学处理 各项数据均以x±SD表示，采用SPSS 19．0统计软件进行方差分析，两组间均数差异采用单因素方差分析，P＜0．05，差异有统计学意义．

2 结果与分析

2．1 沙棘叶黄酮对小鼠模型肝、脾脏器的影响药典记载，沙棘果具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀等功效，沙棘果的主要成分含异鼠李素、异鼠李素－3－β－D－葡萄糖甙、异鼠李素－3－β－芸香糖甙、槲皮素及山奈酚的低糖甙等黄酮类物质［6］．沙棘叶总黄酮是否也有此作用，本实验同时做了脾指数的测定，根据实验结果可知，沙棘叶黄酮对脾脏损伤有抑制作用，但不存在显著差异，表明沙棘叶总黄酮与果总黄酮成分相近者很少或完全不同．

由表1可知，与正常对照组相比，CCl4模型组肝指数明显提高(P＜0．01)，表明CCl4可致小鼠肝脏肿大;与CCl4模型组比较，沙棘叶黄酮各剂量组及联苯双酯组均有降低肝指数的作用(P＜0．01)，实验结果说明沙棘叶黄酮能抑制CCl4所致的小鼠肝脏肿大，并且与联苯双酯组的治疗作用不存在差异(P＞0．05)．

表1 沙棘叶黄酮对小鼠肝指数、脾指数的影响(x±SD，n=10)Table 1 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver index and spleen index in mice

2．2 沙棘叶黄酮对小鼠模型血清GPT、GOT和 AKP的影响 血清中GPT、GOT、AKP活性反映肝细胞变性、坏死程度，也是检查肝功能损害最常用、最敏感的指标，本项研究测定了沙棘叶黄酮对模型小鼠血清GPT、GOT、AKP活性的影响，结果如表2所示．

由表2结果显示，CCl4模型组的 GPT、GOT、AKP活性均极显著高于正常对照组(P＜0．01)，说明肝受损，造模成功．与CCl4模型组比较，沙棘叶黄酮各剂量组及联苯双酯组的AKP、GPT、GOT活性均极显著低于模型组(P＜0．01)．沙棘叶黄酮各剂量组之间比较，中剂量更接近正常值，说明中剂量组治疗效果较好，与联苯双酯组比较不存在显著差异(P＞0．05)．

2．3 沙棘叶黄酮对小鼠模型肝组织POD、SOD和MDA的影响 POD、SOD是体肝内主要的清除自由基及抗氧化酶类．MDA是脂质过氧化产物，其生成量体现了生物膜的受损程度，损伤程度越重，MDA含量越高．他们都和自由基的含量高低密切相关，沙棘叶黄酮对肝组织POD、SOD和MDA的影响，结果如表3所示．

表3结果显示，与正常对照组比较，CCl4模型组的 POD和 SOD显著低于正常对照组(P＜0．01)，MDA高于正常对照组(P＜0．05)，说明肝受损明显，肝内抗氧化酶活力下降，氧化产物增多．与CCl4模型组比较，联苯双酯组、沙棘叶黄酮各剂量组的POD和SOD都高于模型组，MDA都低于模型组，说明沙棘叶黄酮具有提高肝内抗氧化活力(POD和SOD)，降低氧化产物(MDA)的作用．其中，沙棘叶黄酮中剂量组的POD、SOD与模型组比较，有极显著差异(P＜0．01)，MDA有显著差异(P＜0．05)，且治疗效果与联苯双酯组比较，不存在显著差异(P＞0．05)．说明一定剂量(100 mg/kg)的沙棘叶黄酮可达到与联苯双酯组同样的治疗效果．

2．4 沙棘叶黄酮对小鼠模型肝脏病理变化的影响参照文献［13］的方法判断肝损伤程度，按肝细胞水肿量分级如下:1)0级:肝细胞正常;2)Ⅰ级:肝细胞水肿程度小于整个肝组织切片的25%;3)Ⅱ级:肝细胞水肿量占整个肝组织切片的25% ～50%;4)Ⅲ级:肝细胞水肿量大于整个肝组织切片的50%．

表2 沙棘叶黄酮对小鼠血清GPT、GOT和AKP的影响(x±SD，n=10)Table 2 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on serum GPT，GOT and AKP in mice

表3 沙棘叶黄酮对小鼠肝组织POD、SOD和MDA的影响(x±SD，n=10)Table 3 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver tissue of POD，SOD and MDA in mice

病理学检查显示:正常对照组镜下可见肝细胞索结构清晰，肝细胞形态正常，全部属于0级，显微结构见图1A．CCl4模型组镜下见肝细胞呈大片气球样变，肝损伤严重，全部属于Ⅲ级，显微结构见图1B．联苯双酯组镜下可见肝细胞大部分形态较正常，只有极个别细胞异常，90%属于0级，显微结构见图1C．沙棘叶黄酮高剂量组肝细胞病变较模型组较轻，肝细胞点状坏死，60%属于Ⅱ级，显微结构见图1D．中剂量组肝细胞有个别坏死，大部分正常，与联苯双酯药物组几乎差不多，70%属于Ⅰ级，显微结构见图1E．低剂量组肝细胞病变较模型组略轻，90%属于Ⅲ级坏死，结构见图1F．

3 讨论与结论

研究保肝作用常用的动物模型是CCl4急性肝损伤模型．CCl4对肝损伤的毒性作用是通过脂质过氧化作用进行的．CCl4进入肝细胞后，经肝微粒体细胞色素P－450酶激活后生成·CCl3，·CCl3可进一步与氧结合，形成具有更强反应活性的CCl3O－基团，这些自由基可攻击肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，损伤肝细胞膜的结构和功能，使膜通透性升高，导致细胞肿胀坏死［14］．由于CCl4产生的大量自由基损害了肝脏，使肝指数升高．模型组的肝指数显著高于正常对照组，说明肝脏受损水肿．沙棘叶黄酮高、中、低剂量组可以明显降低肝指数，表明沙棘叶黄酮可以有效抑制肝脏肿大，降低肝脏的受损程度，从而保护肝脏．

酶学实验在肝实质损害的诊断中占重要地位，其中应用最广泛的是转氨酶(GPT、GOT)，肝内富含这2种酶，据测定整个肝内转氨酶量约为血清中含量的100倍．当组织发生炎症或损伤时，细胞膜通透性增加，细胞内转氨酶泄漏于血中．因此血清中酶活力升高常与肝组织损伤程度呈平行关系，血清转氨酶活性是肝细胞损害的敏感指标．AKP主要存在于小肠粘膜、肾脏、骨骼和肝脏等组织的细胞膜上，血液中的AKP主要来自于肝脏，因此，测定血清中的AKP也可以判断肝脏的受损情况［15］．结果显示，模型组GPT、GOT、AKP都极显著高于正常对照组(P＜0．001)，说明肝脏受到严重损伤;沙棘叶黄酮中剂量组的值低于CCl4模型组而接近于正常对照组的值，可以抑制血清GPT、GOT、AKP的异常升高，从而保护肝脏．POD和SOD是肝内的抗氧化酶，能够清除自由基，并可抑制自由基启动的脂质过氧化反应．脂质过氧化产物MDA也可以破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀坏死，其含量可反映机体过氧化损伤程度和细胞受损程度．由于肝脏受损，CCl4模型组的酶活力远低于正常对照组，MDA的含量显著高于正常对照组，而沙棘叶黄酮组的酶活力显著高于CCl4模型组．这说明了沙棘叶黄酮可以通过提高POD、SOD酶活性清除自由基，降低MDA的含量，减轻肝受损程度，从而起到保护细胞膜结构与功能的完整作用．

从病理切片可知，CCl4模型组镜下见肝细胞呈大片气球样变，肝损伤严重，从形态学上说明造模成功．黄酮治疗组中剂量组效果较好，其效果与联苯双酯组相当．从形态学上也说明沙棘叶黄酮具有保护肝脏损伤的作用．

根据郑建仙［11］所著《功能性食品》记载:病理结果阳性，2个转氨酶中任何一项阳性，可判定受试物具有对化学性肝损伤有保护作用．综上所述，一定剂量的沙棘叶黄酮具有保肝作用，其作用机制可能是通过提高清除自由基酶的活性，减少自由基引起脂质过氧化反应，维持了肝细胞膜结构和功能完整性，防止转氨酶外泄来实现的．沙棘叶黄酮对小鼠急性肝损伤的保护作用的研究，对有效筛选抗肝损伤的植物源活性成分有着重要的意义，并且沙棘叶来源广泛，价格低廉，对沙棘的综合利用具有更广阔的前景．

［1］卢雪晖，刘丛海，叶丹．保肝药物临床应用情况调查［J］．天津药学，2014，26(1):35－36．

［2］张叶飘，赛娜瓦尔，谢修强，等．药物性肝损害88例回顾性分析［J］．药物流行病学杂志，2015，24(3):155－157．

［3］周鸿堂，陈洁．2012－2013年我院肝病药物应用情况分析［J］．中国民族民间医药，2015(7):122－124．

［4］MARTIN G S，MANNINO D，EATON S，et al．The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000［J］．N Engl J Med，2003，348(16):1546－1554．

［5］FUKAZAWA A，YOKOI Y，KURACHI K，et al．Implication of B lymphocytes in endotoxin－induced hepatic injury after partial hepatectomy in rats［J］．Surg Res，2007，137(1):21－29．

［6］国家药典委员会．中华人民共和国药典(2010版)［M］．北京:中国医药科技出版社，2010．

［7］宋春梅，杜鹃，葛红娟．沙棘果对高脂饲料大鼠血脂和肝脏的保护作用［J］．卫生研究，2015，44(4):628－631．

［8］景小楠，钟菡，张宏，等．黑骨藤中总黄酮含量的测定［J］．四川师范大学学报(自然科学版)，2010，33(1):89－91．

［9］孙敬方．动物实验方法学［M］．北京:人民卫生出版社，2001．

［10］赵效国．新编医学动物实验设计与方法［M］．北京:科学卫生出版社，2009．

［11］郑建仙．功能性食品［M］．北京:中国轻工业出版社，2002．

［12］SHIOJI K，MATSUURA Y，IWASE T，et al．Successful immunoglobulin treatment for fulminant myocarditis andserial analysis of serum thioredoxin，acase report［J］．Cir J，2002，66:977－980．

［13］项伟，夏延斌，余望贻，等．金葛露及其改良产品的解酒保肝作用研究［J］．酿酒，2006，33(3):54－56．

［14］朱淑云．连翘叶茶提取物抗氧化活性的研究［D］．西安:陕西师范大学，2003．

［15］刘旭．溪黄草黄酮对肝纤维化及急性肝损伤治疗作用的实验研究［D］．广州:南方医科大学，2014．

Research of Flavonoids Leaves of Hippophe rhamnoids L．on Acute Liver Injury Protection Effects in Mice

LI Shuzhen1，WU Fei2，YANG Ning1，CHEN Yuelin1

(1．Wulanchabu Medical College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia; 2．Wulanchabu Central Hospital，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia)

Today drugs used to treat liver diseases often bring many negative effects to the patients．It is important to look for a new security active substances from the natural plants to protect liver．Flavonoids of Hippophe rhamnoids L．maybe protect the acute liver injury in mice，and it perhaps provide experimental basis for protective liver medicine．We prepare acute liver injury model in mice with CCl4by gavage，use colorimetric method to measure serum GPT，GOT，AKP activity and liver POD，SOD，MDA content，calculate the liver index and observe liver in pathology slice．Flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．(100 mg/kg)can reduce serum AKP，GPT，GOT content and liver MDA content obviously，improve liver POD and SOD activity in the injury mice．The certain dosage flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．can protect liver in acute liver injury model mice．Its mechanism may be related to flavonoids anti-lipid peroxidation．

flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．;liver injury;mice model;protect liver function

Q949．95;R965．1

A

1001－8395(2016)05－0765－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．05．026

(编辑 李德华)

2015－09－22

内蒙古自治区教育厅高等学校科学技术研究项目(NJZC14407)

李淑珍(1974—)，女，副教授，主要从事天然产物研究与开发的研究，E－mail:448609108@qq．com