乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐盐性

牛 蓓，宋 君，符 佳，李 锐，郭晓恒，邹 亮，雍 彬，郭 静，高孝锦

乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐盐性

牛 蓓1，宋 君2，符 佳1，李 锐1，郭晓恒1，邹 亮1，雍 彬3*，郭 静1，高孝锦1

(1．成都大学医学院，四川成都610106; 2．四川省农业科学院分析检测中心，四川成都610066; 3．四川师范大学生命科学学院，四川成都 610101)

利用RT－PCR和RACE技术，成功获得了乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶(SsCu/Zn SOD)的cDNA全长．该序列含有486 bp的完整开放阅读框(GenBank登录号为KX169161)，编码161个氨基酸残基，推测其相对分子质量为16.304 kDa，等电点为6.57．对应开放阅读框的基因组序列含有7个外显子和6个内含子．同源性及保守结构域分析显示SsCu/Zn SOD和其他物种的Cu/Zn SOD有较高的同源性(67.26% ～88.69%)，含有一个保守的活性区．构建原核表达载体pET32－SsCu/Zn SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，诱导出目的蛋白．转化菌的盐胁迫实验显示，其具有抗盐胁迫的功能．

SsCu/Zn超氧化物歧化酶基因;克隆;原核表达;盐胁迫

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的抗氧化酶［1］．SOD根据结合的金属离子的不同可以分为三大类，即 Cu/Zn SOD、Fe SOD和Mn SOD［1－2］．在植物中，Cu/Zn SOD是植物体内清除超氧阴离子最主要的SOD酶类，主要以同源二聚体形式存在于细胞质和叶绿体中［2－4］．其含有与SOD活性相关的Cu离子和稳定活性中心结构的Zn离子［5］．该酶与植物的抗旱、抗盐碱、耐低温以及耐高温等多种抗逆性密切相关，受到多种逆境及激素因子的影响［6］．近年来，不同植物中的超氧化物歧化酶基因被陆续克隆［1，3，5］，有报道显示转SOD基因的细菌［7］和植物［8］在逆境胁迫下，都表现出活性增加或抗性增强的作用．

乌桕为我国四大油料树种之一，其种子含油量高达41% ～47%［9］，其中饱和脂肪酸含量约为40%，不饱和脂肪酸含量约占60%［10］，脂肪酸的碳链长度主要集中在C17—C20，与普通生物柴油主要成分的碳链长度类似［11］．因此乌桕生物质能的研究成为近期热点．由于乌桕具有良好的抗逆性能［12］，而SOD活性高低可以用作植物抗逆性强弱的判断的标准之一［6－7］．因而，乌桕SOD转性的研究为进一步分析其抗逆性的可能机理，改良育种提供一定的理论基础．本研究通过RT－PCR及RACE技术，从乌桕中克隆出Cu/Zn超氧化物歧化酶(Ss-Cu/Zn SOD)的阅读框及相应DNA序列，对其进行生物信息学分析．构建原核表达载体pET32－Ss-Cu/Zn SOD，转入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导出目的蛋白．并在高盐胁迫下，对SsCu/Zn SOD基因重组菌的耐受性进行探讨．

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料 乌桕树叶采集于四川省仁寿县．幼嫩的叶子采摘后立刻放入样品保存液中，回实验室后将样品冻存于－80℃超低温冰箱中备用．

1.1.2 菌株及常用质粒载体 大肠杆菌(Escherichia coli)Top10、BL21(DE3)、原核表达载体pET32a(+)均由四川大学生物资源与生态教育部重点实验室保存．克隆载体pEASY－T购自北京全式金生物技术有限公司．

1.1.3 各种酶、试剂盒及试剂 酶:rTaq酶、Prime-STARTM酶、反转录酶M－MLV、各种DNA限制内切酶均购于TaKaRa公司;试剂盒:胶回收试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、植物总RNA提取试剂盒购于北京天根公司，反转录试剂盒购于Takara公司，质粒提取试剂盒购自Omiga公司．琼脂糖、琼脂粉、Tris、SDS、IPTG、X－gal购于Fluka，其他化学药品为进口或国产分析纯和色谱纯试剂．

1.1.4 引物 引物均由北京华大基因公司合成，如表1所示．

表1 实验所用引物Table1 Primers used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 乌桕叶RNA的提取 使用北京天根公司植物总RNA提取试剂盒提取乌桕叶片总RNA．用NanoVue超微量分光光度计测定核酸浓度，采用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性．

1.2.2 乌桕Cu/Zn SOD基因的克隆 保守区片段、5'端和3'端RECE片段克隆:通过BLAST对比，根据保守区设计一对简并引物Cu31和Cu32(表1)．用纯化的RNA为模板，以oligo(dT)18为反转录引物，进行反转录．再分别以2个简并引物和3个特异引物(Cu31、Cu32、Cu51、Cu52和Cu53)以及2个通用引物AP1和 AP2(表1)．通过5'－ RACE和3'－RACE的方法［13］，分别扩增得到Ss-Cu/Zn SOD基因的3'端和5'端片段．对扩增片段跑胶、回收并测序比对验证其正确性．所有反应程序均为:95℃、5 min;35个循环(94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸8 min，16℃保温．所得的产物经电泳检测，并回收、连接、转化、测序(北京华大基因公司)．测序结果在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否属于Cu/Zn SOD基因．

阅读框和相关DNA序列的克隆:根据前面所得的3'和5'测序结果拼接片段，再根据该片段设计引物Cu ORF1和Cu ORF2，采用高保真PrimeSTARTM聚合酶分别以cDNA和DNA为模板，克隆SsCu/Zn SOD基因的阅读框序列和相关 DNA序列．反应程序为:95℃、5 min;35个循环(94℃、40 s，50℃、50 s，72℃、2 min)，72℃延伸10 min，4℃保温．所得的产物经电泳检测，并回收、连接、转化、测序(北京华大基因公司)．所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否属于SsCu/Zn SOD基因．

1.2.3 乌桕Cu/Zn SOD生物信息学分析 采用生物软件:DNAMAN 6.0、Primer Premier 5.0．

使用的网上数据库和在线分析软件如下:

Blast:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/ ORF finder:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/gorf/ gorf．html

ComputepI/Mw:http://www．expasy．org/tools/pi_ tool．html

Conserved domains:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/ Structure/cdd/wrpsb．cgi

SWISS－MODEL:http://swissmodel．expasy．org/ Spidey:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/

1.2.4 乌桕Cu/Zn SOD基因的原核表达 Cu/Zn SOD基因原核表达ORF的制备:根据所得的阅读框序列，设计原核表达的特异引物Cuyh1和Cuyh2，以cDNA为模板，获得Cu/Zn SOD基因的原核表达ORF．PCR程序为:95℃、5 min;35个循环(94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸10 min，16℃保温．PCR产物使用DNA纯化回收试剂盒回收放入－20℃备用．

载体构建:用 BamHI和 XhoI内切酶将重组pEASY－T－SsCu/Zn SOD质粒和pET32载体进行双酶切，胶回收后，用T4连接酶在16℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10，获得重组表达载体pET32－SsCu/Zn SOD．

原核表达:将构建好的重组质粒pET32－Ss-Cu/Zn SOD转化到原核表达菌株BL21(DE3)．转化子于LB培养基中37℃，250 r/m培养至OD600达到0.6，加入终浓度为1 mM的IPTG，诱导4 h后离心收集菌体，加入上样缓冲液，振荡悬浮、破碎离心，取上清进行质量分数12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS－PAGE)电泳检测．

1.2.5 乌桕Cu/Zn SOD基因重组菌对盐胁迫的耐受性 将重组菌置于2 mL LB(含有50 μg/mL Amp)液体培养基中过夜培养，取100 μL将其接入10 mL含Amp的液体LB中培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养4 h．按1%比例，取500 μL此培养物和对照菌BL21(DE3)分别移入50 mL含800 mmol/L NaCl液体LB培养基(其中含有 IPTG终浓度为1 mmol/L，Amp 50 μg/mL)中．继续培养2 d，每间隔4 h，利用紫外分光光度仪测定OD600值，绘制生长曲线．实验均重复3次．

2 结果与分析

2.1 乌桕SsCu/Zn SOD全长cDNA的克隆 根据GenBank中登录的Cu/Zn SOD基因的保守序列设计简并引物，以乌桕叶cDNA为模板，通过巢式PCR扩增得到大约526 bp的3'端片段，如图1 (A)，将得到的片段回收测序．测序结果在NCBI数据库进行Blastn比对，发现和其他高等植物的Cu/ Zn SOD基因序列有很高的相似性．因此初步推测获得的序列为乌桕的SsCu/Zn SOD基因片段．根据该序列设计特异引物，采用TdT末端加尾和巢式PCR的方法获得了长度大约为397 bp的5'端序列如图1(B)所示．

将获得的3'端序列和5'端序列进行拼接，得到全长cDNA．用NCBI的ORF finder功能分析后发现这段序列含有一个完整的ORF框，长度为486 bp，编码161个氨基酸．根据拼接序列，设计一对特异引物Cu ORF1和Cu ORF2对cDNA和DNA分别进行PCR扩增，获得486 bp SsCu/Zn SOD ORF序列如图1(C)和ORF对应2 901 bp DNA序列如图1 (D)．基因GenBank登录号为KX169161．

图1 乌桕的SsCu/Zn SOD基因3'端片段、5'端片段、ORF和ORF区的DNA序列的克隆Fig.1 Amplification of the 3'fragments，the 5'fragments，ORF and genomic DNA of SsCu/Zn SOD gene

2.2 乌桕的SsCu/Zn SOD的生物信息学分析利用Compute pI/Mw进行分析，发现成熟肽的分子量为16．304 kDa，等电点为6．57．同源性比对结果显示，乌桕SsCu/Zn SOD全长氨基酸序列和其他物种有较高的同源性(67．26%～88.69%)，具有一个保守的活性中心序列，其中含有Cu和Zn结合的位点(图2(A))．保守结构域分析结果也显示，活性中心位点包含组氨酸52、54、69、86、126和天冬氨酸89．Cu2+结合位点是组氨酸52、54、69和126，Zn2+结合位点是组氨酸69、77、86和天冬氨酸89(图2 (B))，这和其他已知的Cu/Zn SOD中Cu、Zn离子结合的配基是一样的，说明了这些配基对 Cu/Zn SOD发挥正常功能非常重要［14－15］．通过 Swissmodel构建蛋白高级结构模型(图3)结果显示，该蛋白和库中2q2l.1．A模型序列有68.46%的一致性．其主要包含8个β折叠和1个无规则卷曲．

图2 乌桕SsCu/Zn SOD氨基酸序列分析Fig．2 Amino acid sequence analysis of SsCu/Zn SOD from S．sebiferum

图3 SsCu/Zn SOD的结构模拟Fig．3 structure modeling of SsCu/Zn SOD

2.3 乌桕的SsCu/Zn SOD阅读框相关的DNA序列分析 将克隆的阅读框和相关DNA序列在Spider软件中进行内含子和外显子分析，结果如图4显示，该基因含有7个外显子和6个内含子，边界符合AG/GT规则．其活性中心位点的组氨酸52、54位于第2个外显子上，组氨酸69、86和天冬氨酸89位于第3个外显子上，组氨酸126位于第5个外显子上．

2.4 乌桕SsCu/Zn SOD原核表达 将SsCu/Zn SOD基因的ORF与pET32a(+)载体进行重组，构建了原核表达 pET32－SsCu/Zn SOD重组质粒，转入大肠杆菌 BL21(DE3)表达菌株中，经IPTG诱导后，对表达产物进行了SDS－PAGE电泳检测(图5)．

通过对电泳图的分析，在IPTG的诱导下，含重组质粒的菌中出现了一条大量表达的蛋白条带，分子量约为34 kDa，除去载体本身含有17.633 kDa的标签蛋白，即得到一个约为16 kDa的蛋白质，大小和理论预测值相符．

图4 SsCu/Zn SOD基因区外显子分析Fig．4 Exon analysis of genomic region of SsCu/Zn SOD

图5 SsCu/Zn SOD重组蛋白的诱导表达Fig．5 SDS－PAGE analysis of recombinant SsCu/Zn SOD protein

2.5 乌桕SsCu/Zn SOD基因重组菌对盐胁迫的耐受性 为了进一步了解该基因的功能，将含有空载pET32的大肠杆菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/ Zn SOD载体的重组菌BL21(DE3)，分别在正常条件(培养液中IPTG终浓度为1 mmol/L)下进行培养，并绘制生长曲线，如图6(A)所示．同时，将另外一组含有空载pET32的大肠杆菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/Zn SOD载体的重组菌BL21(DE3)分别在高盐条件(培养液中含800 mM的 NaCl，IPTG终浓度为1 mmol/L)下进行诱导培养，绘制生长曲线，如图6(B)所示．图6(A)结果显示含有重组载体的菌群和含有空载pET32菌群，在正常情况下其生长速度基本接近．而高盐胁迫下，pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比含有空载pET32菌株延滞期缩短，如图6(B)，生长速度快，说明pET32－Ss-Cu/Zn SOD的菌株对高盐的抗性比含有空载pET32菌要强．由于pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比空载菌株多含有 SsCu/Zn SOD基因，其能在IPTG诱导下表达出重组 SOD，因而推测其重组SOD在耐盐上发挥一定的作用．

图6 含pET32－SsCu/ZnSOD大肠杆菌对盐胁迫的耐受性Fig．6 The tolerance to salt stress of E．coli with pET32－SsCu/ZnSOD

3 讨论

本研究从乌桕中分离得到一个Cu/Zn SOD基因．通过同源序列比对及保守结构域分析，发现该基因推测的理论蛋白与其他物种中的同源蛋白同源性较高(67.26%～88.69%)，且具有一个保守的活性中心序列，其中含有Cu2+结合位点(组氨酸52、54、69和126)和Zn2+结合位点(组氨酸69、77、86和天冬氨酸89)．同源建模显示，该蛋白主要由β－折叠组成，α－螺旋很少，结构核心是8股反平行的β－折叠组成具有拓扑性的桶．有文献报道Cu2+与4个组氨酸以及一个水配位，构成酶的活性中心，Zn2+与3个组氨酸的咪唑氮及1个天门冬氨酸的羧基氧离子配位，形成扭曲的四面体结构［16－17］．除去Zn2+而保留Cu2+的话，SOD仍然保持较高的活性，而除去Cu2+的酶则失活［6］．

大多数文献显示外源SOD基因的转入能增加生物的抗逆性．如曲妍妍的研究显示番茄中的叶绿体Cu/Zn SOD基因转入进烟草中，转基因烟草与对照相比耐低温胁迫能力增强［18］．S.C.Lee等将Cu/ Zn SOD在水稻中过表达提高了水稻对冷胁迫的抗性．不过，L.H.Pitcher等［20］将矮牵牛叶绿体Cu/Zn SOD转化烟草后，烟草中Cu/Zn SOD的活性虽提高了30～50倍，却没有提高对百草枯或臭氧引起的氧化损伤的耐受性．综上可知，SOD转基因生物在一定程度上可以提高生物对不同胁迫带来的氧化损伤的抗性，但不同的生物间存在差别，关于其活性与抗逆性直接的关系还需要进一步的研究．本研究为初步了解SsCu/Zn SOD的功能，设计耐盐性实验考察重组表达菌在高盐胁迫下的生长情况．实验发现重组菌与对照相比具有较明显的生长优势，说明SsCu/Zn SOD蛋白在提高重组菌耐盐性上具有一定作用．这一结论与臧洁等人的研究结论一致．其将盐角草Cu/Zn SOD基因转入大肠杆菌，在盐胁迫下，转Cu/Zn SOD基因的大肠杆菌生长量与对照菌相比有一定的增加［7］．此外，通过构建原核表达载体，成功获得与预测分子量相同的目的蛋白质，推测该蛋白可能是乌桕 SsCu/Zn SOD天然二聚体的寡聚单体形式．未来的工作将对目的蛋白进行纯化并验证活性，以求进一步了解该蛋白的功能．

致谢 成都大学自然科学青年基金(2010XJZ29)及成都大学大学生创新训练计划孵化培育项目对本文给予了资助，谨致谢意．

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Cloning and Salt-tolerance Analysis of SsCu/Zn SOD Gene from Sapium Sebiferum

NIU Bei1，SONG Jun2，FU Jia1，LI Rui1，GUO Xiaoheng1，ZOU Liang1，YONG Bin3，GUO Jing1，GAO Xiaojin1

(1．School of Medical，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan; 2．Center of Analysis and Test，Sichuan Academy of Agriculture Science，Chengdu 610066，Sichuan; 3．College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

A full-length SsCu/Zn SOD gene from S．sebiferum containing a 486 bp open reading frame encoding 161 amino acid residues was obtained by RT-PCR and RACE technology，and the gene was deposited into GenBank with the accession number of KX169161．The molecular weight and isoelectric point of the mature protein were predicted to be 16．304 kDa and 6．57，respectively．The genomic region corresponding to the open reading frame has 7 exons and 6 introns．The homology modeling analysis showed that Ss-Cu/Zn SOD shared a high degree of sequence similarity with other plant Cu/Zn SOD(67．26% ～88．69%)and a conserved active region．Recombinant plasmid pET32-SsCu/Zn SOD was constructed and expressed in E．coli BL21(DE3)．Salt stress analysis of transformed bacteria indicated that SsCu/Zn SOD might confer transformed bacteria salt-tolerance．

SsCu/Zn SOD gene;cloning;prokaryotic expression;salt stress

Q946

A

1001－8395(2016)05－0743－07

10.3969/j．issn.1001－8395.2016.05．022

(编辑 陶志宁)

2016－04－02

四川省教育厅自然科学重点基金(12ZB178)

*通信作者简介:雍 彬，男，博士，主要从事微生物学、生化与分子生物学的研究，E－mail:binyong1225@163．com