新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究

吴梦纤, 章芳, 王晓亮, 张亚平,*, 孙燕飞

石河子大学生命科学学院, 新疆, 石河子 832000

新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究

吴梦纤1, 章芳1, 王晓亮1, 张亚平1,*, 孙燕飞1

石河子大学生命科学学院, 新疆, 石河子 832000

玛纳斯湿地土壤不同土层和不同地区中可培养真菌的筛选和分子鉴定, 对土壤总DNA的提取后进行PCR扩增后DGGE图谱的分析来研究真菌的多样性, 采用了DNA快速提取法、PCR—DGGE技术以及blast序列比对分析, 得到土壤中11种相似度较低的可培养真菌, 以及对不可培养真菌中22条不重复序列构建的系统发育树。玛纳斯湿地土壤中真菌在不同季节数量有变化, 种类也存在一定的差异。不同样地间同一季节真菌种类不同, 同一样地不同土层间真菌种类也不是完全相同。不可培养真菌之间的差距要比可培养真菌之间的差距大。

土壤; 真菌; DGGE

1 引言

土壤真菌(soil fungi)[1]可以作为生态系统健康的指示物, 它分解有机质, 为植物提供养分, 其多样性与土壤水分、有机质含量、植物多样性呈正相关; 在土壤生态系统中, 真菌发挥着降解半纤维素等、还原氮、溶解磷、防治植物病害等重要功能。自然环境的真菌在气候变化、环境污染和人类活动等多因素影响下, 其种类、数量、分布都发生了明显变化。人们越来越重视对真菌多样性的研究, 而研究一定区域内土壤真菌的多样性将有助于我们了解该区域生态状况和有益的微生物资源。

2 研究材料与研究方法

本文主要针对玛纳斯湿地微生物生态系统中的真菌的分布情况和类别进行研究分析。

目前对干旱区荒漠绿洲玛河流域生态系统的微生物多样性的系统研究, 依然处于空白阶段。玛河流域独特的地理位置以及其特别的气候环境, 有存在稀有微生物资源的可能, 同时也可以帮我们发现玛河流域的微生物生态系统在维持绿洲生态平衡、涵养水源、储藏微生物基因资源等方面的重要作用,因此值得对其进行研究。新疆玛纳斯湿地位于玛纳斯河流域、地处我国古尔班通古特沙漠南缘, 属于干旱半干旱地区, 生态环境脆弱。但因为位于绿洲经济带腹地, 所以其生态位区就显得极为重要。通过对玛纳斯湿地微生物的研究, 能对玛河流域农业生产和经济发展起到一定的促进作用。

真菌的分类鉴定是一项浩大的系统工程, 传统的真菌分类学由于经常会得出假阳性或者假阴性的结果, 为准确鉴定真菌的类别造成了一定的难度。现代分子生物学技术中, 利用PCR技术扩增真菌核糖体 ITS(Internal Transcribed Spacer)基因区段进行真菌鉴定的方法得到了迅速的发展。

2.1 研究区概况

本研究区新疆玛纳斯河国家湿地公园规划区中部有三大蓄水水库, 并有小型水库、鱼塘、沼泽、芦苇滩沟通水系。样地位于亚洲大陆腹地经纬度为43°03—46°03' N,84°48'—86°42' E, 属干旱半干旱温带大陆型气候, 干旱少雨, 日照充足, 热量丰富, 四季分明, 冬季严寒, 春季酷热等是其主要特征。样地的年平均气温为6.8—7.1℃, 年平均日照为2886 h,年平均降水量205.7 mm, 年平均蒸发量1648.4 mm,相当于降水量的4—11倍。样地海拔约350—650 m,土壤类型： 灰漠土、潮土、盐土、平原林土、草甸土、沼泽土。湿地内生长有沼泽植物、草甸植物和盐生植物等多种植物(其中药用植物50多种), 生活着大量水生、陆生动物(Ⅰ、Ⅱ级保护动约15种), 是世界候鸟迁徙 3号路线的重要迁徙停歇地、繁殖地[2], 微生物资源丰富、代谢类型多样。

图1 真菌18S rDNA及ITS位置示意图Fig. 1 Position of the annealing sites of fungal 18S rDNA and ITS primers used in this study

2.2 土样采集

本次试验于2013年进行采样, 由于新疆的特殊气候导致冬季持续时间较长, 土壤冻结程度较高,所以采集土壤时间为春季(5月), 一共分为盐土、平原林土、潮土、沼泽土、草甸土以及人工种植土(葡萄园)6个采集样点, 每个样点分别采集1—10 cm、11—20 cm的土样。采集时使用对角线法, 将同一样点同一平面土壤混合后取对角线两侧土壤, 保存。

2.3 试验方法与数据处理

2.3.1 菌种筛选

根据土壤真菌对营养需求的不同, 要采用不同成分的培养基进行培养筛选, 通常培养真菌主要使用马丁氏培养基(孟加拉红培养基)、马铃薯琼脂培养基、麦芽浸汁琼脂培养、松膏培养基等等, 其中最为常用的真菌分离和计数培养基是马丁氏培养基和马铃薯培养基。本次试验选择培养基马铃薯培养基和马丁氏培养基并充分培养以获得更多的种类和数量, 同时用马丁氏培养基分离单菌落用于菌种鉴定。

具体试验方法为： 将5 g土样于45 mL蒸馏水中进行震荡混匀30 min, 然后静置10 min后, 上清液为10-1倍的土壤菌悬液, 取1 mL稀释至10-2倍, 再取1 mL 10-2倍菌悬液稀释至10-3倍, 再将制好的已灭菌(1×105Pa灭菌30 min)培养基放凉至60℃左右,加入链霉素。采用混板法倒板, 培养真菌, 分离培养皿中的单菌落于马铃薯培养基中。

2.3.2 DNA快速提取法提取真菌DNA

将分离出的单菌落于液体马铃薯培养基中摇菌3天后12000 rpm离心10 min收集菌体, 加入少量石英砂后按1∶1加入DNA快速抽提buffer和酚氯仿,摇床摇菌1.5 h, 12000 rpm离心10 min收集上清液,加入1/10的3 M醋酸钠混匀后, 在液体中加入等体积的异丙醇室温静置40 min, 12000 rpm离心10 min,弃上清, 使用70%乙醇洗涤后12000 rpm离心10 min,再用100%乙醇洗涤一次, 12000 rpm离心10 min后倒掉清液, 将EP管于超净工作台中吹干, 确认无乙醇残留后加入适量TE溶液溶解DNA得到DNA溶液。

2.3.3 PCR扩增产物的连接转化测序

用引物EF4、ITS4进行PCR扩增得到2000 bp左右真菌 18S DNA ITS区扩增片段, 双酶切(hhaI/ ffa1)筛选后, 将得到的PCR产物纯化后进行连接转化, 再测序鉴定种属。

本试验测序均为上海生工测序, 使用 Excel 2013对数据进行编辑整理, 用Blast进行序列比对。

2.3.4 土壤总DNA的提取

土壤总DNA的提取采用天泽基因 DNAout 试剂盒提取。

2.3.5 PCR—DGGE

用含GC夹的引物ITS1和ITS2对土壤总DNA进行PCR扩增, 得到340 bp左右的真菌ITS区基因片段进行DGGE。对DGGE得到的电泳图谱进行图像处理, 同时对较明显条带进行切胶回收后使用不含GC夹的引物ITS1和ITS2再次进行PCR, 将得到的产物连接转化后测序。

本试验测序均为上海生工测序, 使用 Excel 2013对数据进行编辑整理, 用Blast进行比对。3 研究结果

3.1 真菌种属鉴定

采集样地A点位于新户坪水库, B点位于小海子水库, C点位于下桥子三村水库。

本次试验采取6个样地的土壤A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、B2-1、B2-2、C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、CK1、CK2,共有12个土样。分别代表着6种不同土壤类型条件下两个土层四个季节的真菌种群变化。通过加入不同梯度浓度土壤悬浮液的马铃薯培养基中挑取单菌落在马丁氏培养基中进行培养, 共分离出明显不同的单菌落84株。

对84株真菌进行DNA提取后再进行PCR, 所得产物进行双酶切处理, 得到不同DNA条带所对应的菌株后连接转化测序, 所得序列片段通过 NCBI进行Blast分析, 得到11种相似度较低的菌种, 分别为粗糙脉孢霉(Neurospora crassa); 斜卧青霉(Penicillium decumbens); 青霉菌(Penicillium); 肉座菌科(Hypocreaceae); 金龟子绿僵菌(Metarhizium);枝顶孢属(Acremonium); 被孢霉属(Mortierella); 产紫青霉(Penicillium purpurogenum); 枯萎病菌(Fusarium solani); 产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum);扩展青霉(Penicillium expansum)。[5]

用转化所得克隆体进行测序, 得到结果进行blast比对。

3.2 DGGE图谱分析

通过 ITS区通用引物 ITS1和 ITS2对土壤总DNA进行含 GC夹的 PCR, 将得到的产物进行DGGE处理, 使用扫描成像仪拍摄电泳图谱。

将DGGE图谱使用Quantity One软件进行处理,得到的处理数据导入Excel 2003, 应用Shannon指数计算 DGGE条带丰度, 得到的结果如表 2所示。Shannon—Wiener index( H)计算方法采用罗海峰等的方法[12]。

通过对PCR—DGGE图谱进行条带切割后的胶回收, 得到约340 bp的DNA片段。胶回收后进行使用不含GC夹ITS1和ITS2引物的PCR反应得出的PCR产物进行连接转化测序反应, 得到的序列使用MEGA6.0软件进行系统发育树分析。

表1 玛纳斯湿地春季(5月)可培养真菌鉴定Tab. 1 The culturable fungi identification from Manas Wetland in May

表2 玛纳斯湿地春季(5月)不同区域土壤中真菌DGGE图谱条带数和多样性Tab. 2 DGGE band number and Shannon index of fungi communities in soil from different area in Manas Wetland in May

图2 玛纳斯湿地春季(5月)土壤真菌ITS区PCR—DGGE图谱Fig. 2 The ITS area PCR-DGGE picture of fungi on Manas Wetland in May

4 结论

根据表 1显示数据, 我们得到玛纳斯湿地可培养真菌包含11种菌属, 其中也包含了同属不同种的菌群。这些菌种中青霉菌属的种类远大于其他种属菌群含量, 这说明了玛纳斯湿地由于其土壤中水含量较高, 较适于青霉菌属生长。枯萎病菌的出现则证明了玛纳斯湿地中植被存在枯萎病现象, 需求展开对枯萎病的防治工作。

由图2显示的玛纳斯湿地5月份土壤根际真菌DGGE图谱, 向我们直观展示了玛纳斯湿地春季(新疆春季较晚)土壤中真菌的含量。由图我们可以看出玛纳斯湿地中葡萄田土壤(即 CK土壤)中真菌密度明显大于天然湿地的土壤, 而新户坪水库土壤中真菌的含量明显高于小海子水库, 下桥子三村水库的芦苇根际土壤中真菌含量最低, 丰度也远远不如新户坪水库的真菌含量高。

表2则展示了不同区域中真菌含量和丰度的具体特性。在这几处样地中, 每个样地的1—10 cm土壤中真菌DGGE的条带数基本都大于11—20 cm土壤中的。每个样地两个土层的土壤中真菌多样性的指数都相似, 1—10 cm的土壤真菌多样性指数大部分小于11—20 cm土壤。

DGGE图谱所不能直观展示的玛纳斯湿地不可培养真菌间的亲缘关系, 在系统发育树(图3)中得到了体现。在图中可以看到不同样地中含有的不可培养真菌之间存在共通性, 亲缘关系较近。

玛纳斯湿地土壤中真菌的种类较其他自然环境土壤中真菌多一些, 但不如农田的土壤中真菌含量多, 这说明农田土壤由于经常翻起、浇水等人为因素可以使真菌的繁育更加容易, 同时种类也会更多。而由于地下水资源的流通, 土壤中真菌资源得以传播和交流。玛纳斯湿地较多的降雨量和水资源储备, 给真菌的流通创造了便利的条件, 致使三个水库中真菌资源有一定程度的共享。同时丰富的水资源也为人工种植各种农作物创造了便利的条件。

本次试验中所发现的枯萎病菌的存在在一定程度上会威胁到玛纳斯湿地农作物的生长, 希望能够得到玛纳斯湿地地区附近农业产业的重视。

本文所写出的仅仅是玛纳斯湿地土壤真菌资源中极少的一部分, 并不涉及落叶凋零物上的真菌。因所使用的分离方法和培养基的不同, 分离出的真菌种类也有很大差异。要对整个玛纳斯湿地丰富的土壤真菌资源进行全面准确地调查和鉴定, 需要多种不同的取样方法、取样时间和分离方法。整个玛纳斯湿地丰富的土壤真菌资源有待进一步调查,, 尤其是该地区特殊的自然环境条件、人为生态环境条件下, 植物内生真菌以及植物凋零物上丰富的真菌多样性和生态学意义的研究, 这对新疆的“退耕还湿地”和农垦开发将具有极其重要的意义。

图3 玛纳斯湿地春季(5月)DGGE测序真菌系统发育树的构建Fig. 3 The DGGE phylogenetic tree of fungi in Manas Wetland in May

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The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang

WU Mengxian1, ZHANG Fang1, WANG Xiaoliang1, ZHANG Yaping1,*, SUN Yanfei1The College of Life Ccience of Shihezi University, Shihezi 832000, China

In this paper, the fungi of different region and different soil layers in Manas Wetland were screened, and the soil fungal diversity was studied by method of DNA fast extraction, and PCR-DGGE technology and blast sequence analysis. 11 culturable strains and 22 unculturable strains were obtained, and similarity of 11 culturable strains was low. Phylogenetic tree of 22 unculturable strains was built. Overall, the numbers and the variety of fungi were different among seasons; variety of fungi was different among sampling plots in the same season, and among soil layers in the same sampling plots. The difference among unculturable strains was bigger than culturable strains.

soil; fungus; DGGE

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.020

Q

A

1008-8873(2016)01-130-06

2015-01-26;

2015-03-06

吴梦纤(1990—), 女, 新疆克拉玛依人, 在读研究生学位, 从事土壤微生物研究, E-mail： wmq0915@qq.com*通信作者：张亚平, 女, 博士, 教授, 主要从事微生物学研究, E-mail： 510224419@qq.com

吴梦纤, 章芳, 王晓亮, 等. 新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究[J]. 生态科学, 2016, 35(1)： 130-135.

WU Mengxian, ZHANG Fang, WANG Xiaoliang, et al. The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 130-135.