右美托咪啶对创伤性脑损伤大鼠海马区神经元自噬的影响

谷志杰, 张满和, 周秀敏, 邢彦杰, 赵　昕, 张树立

(1. 河北省唐山市乐亭县医院, 河北 乐亭，063600; 2. 河北省唐山工人医院, 河北 唐山, 063000)



右美托咪啶对创伤性脑损伤大鼠海马区神经元自噬的影响

谷志杰1, 张满和2, 周秀敏2, 邢彦杰2, 赵昕2, 张树立2

(1. 河北省唐山市乐亭县医院, 河北 乐亭，063600; 2. 河北省唐山工人医院, 河北 唐山, 063000)

摘要:目的探讨右美托咪啶对创伤性脑损伤(TBI)大鼠海马区神经元自噬的影响。方法采用改良自由落体装置制备成年SD大鼠脑损伤模型，TBI后立即静脉注射右美托咪啶15 μg/kg。采用神经损伤评分评价运动功能，Morris水迷宫测试大鼠空间学习能力。LC3和NeuN的共定位。免疫印迹分析LC3的表达量。结果与TBI组比较，Dex组NSS差值显著降低(P<0.05)。与sham组比较，TBI后所有大鼠在24、48 h逃避潜伏期显著增加(P<0.05)。与TBI组比较，Dex组在48 h逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)。与TBI组比较，Dex组显着抑制6、12、24 h的LC3Ⅱ上调(P<0.05)。结论TBI后应用右美托咪啶能显著改善运动和认知功能，抑制海马区神经元的细胞自噬，促进神经功能的恢复。

关键词:创伤性脑损伤; 右美托咪啶; 水迷宫; 自噬; 海马区; 神经功能

创伤性脑损伤(TBI)是导致死亡和残疾的主要原因[1-3]。右美托咪啶作为一种高效和高度选择性的α2-肾上腺素能受体激动剂，具有催眠、镇静、抗焦虑、交感神经阻滞和止痛的功能，且不产生显著的呼吸抑制[4-5]。大量研究[6-8]表明右美托咪啶对缺血性脑损伤能起到神经保护作用。本研究探讨右美托咪啶对创伤性脑损伤大鼠海马区神经元自噬的影响，报告如下。

1材料与方法

1.1动物选择

健康雄性SD大鼠120只，12～16周，体质量340～370 g(北京维通利华实验动物技术有限公司)。所有动物饲养在12 h周期光照/黑暗环境中，在手术中或手术前后自由饮水摄食。

1.2颅脑损伤模型的制备

TBI的动物模型由改良自由落体装置制成[9]。将大鼠用戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉后中线切开局部皮肤，露出颅骨骨缝，将一个直径10 mm、厚度3 mm钢片以耳脑胶黏附到冠状缝与矢状缝交点处。将动物移至自由落体装置下一个海绵垫上，450 g铜锤通过1.5 m的垂直管自由落下打击钢片，造成大鼠弥漫性脑损伤。sham组动物接受相同的手术，但不接受重锤冲击。手术后的大鼠消毒缝合头皮后，安置在单独的笼子里，放有37 ℃的热垫，使其在24 h恢复期维持正常体温。

1.3分组与用药

120只大鼠被随机分为sham组、TBI组和Dex组。3组又细分为4个亚组，每亚组10只大鼠。各亚组10只大鼠分别在创伤性脑损伤后6、12、24和48 h处死。Dex组大鼠在创伤性脑损伤后立即静脉注射右美托咪啶15 μg/kg(江苏恒瑞药业有限公司，20120425)。

1.4运动功能恢复及空间学习能力

采用神经功能缺损程度评分(NSS)评价大鼠的神经功能状态，包括测试反应、警觉性、协调、运动能力。10分代表神经功能损害最大，0分代表神经功能正常[11]。损伤24、48 h后分别由1名并不知情的人员进行NSS测试。计算每只大鼠最初和后续时间段NSS差值，该差值反映大鼠自发或由治疗引起的运动功能恢复。

空间学习记忆能力的评估在Morris水迷宫内进行。术前所有大鼠经科学、有序地训练使它们找到安全岛的时间无差异。在每一个试验中，大鼠被随机放入一个象限开始点(N、S、E或W)，面向池壁，允许其60 s内逃到一个平台，如果未在90 s内找到安全岛，则回笼等待下一次实验。计算5个试验的平均逃避潜伏期。该测试在伤后24、48 h进行。

1.5分析方法

蛋白质印迹分析：将大鼠深度麻醉后进行灌注固定。海马CA1区被迅速隔离；总蛋白被提取出来，蛋白浓度通过BCA试剂(Solarbio，北京)测定。样品进行凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移至PVDF膜上(Roche Diagnostics公司，曼海姆，德国)。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。滴加兔抗大鼠的LC3多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜，洗膜后加羊抗兔的二抗(1∶6 000)室温孵育2 h，ECL显色并曝光，软件分析其条带的灰度值。

免疫荧光分析：将脑组织在4%的多聚甲醛中固定24 h, 注入30%的蔗糖溶液中(0.1 mol/L PBS, pH 7.4)，TBI大鼠海马区由前向后被切成每个部分相距200 μm薄片，OCT包埋。0.4%的Triton-X100打孔10 min, 驴血清封闭1 h。滴加兔抗-LC3多克隆抗体(1∶100)和抗神经元细胞核多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司；圣克鲁斯，CA，USA，1∶100稀释)的混合物在4℃孵育过夜。滴加二抗37℃避光孵育2 h。照片放在激光扫描共聚焦显微镜中(Olympus FV1000)。

1.6统计学处理

采用SPSS16.0进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示。组内比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

TBI组和Dex组24、48 h的NSS差值分别为(5.2±0.4)、(4.6±0.5)和(2.4±0.3)、(1.6±0.2)，Dex组NSS差值显著低于TBI组(P<0.05)，表明右美托咪啶能减轻脑外伤引起的运动障碍，有助于创伤性脑损伤后运动功能的恢复。同时，sham组，TBI组和Dex组24、48 h的逃避潜伏期分别为(17.5±2.1)、(16.9±2.3)和(58.7±6.5)、(52.1±5.0)和(51.2±4.7)、(40.8±4.1)。TBI组和Dex组逃避潜伏期显著长于sham组(P<0.05)，且TBI组逃避潜伏期显著长于Dex组(P<0.05)。

24 h后观察TBI组LC3和NeuN共定位的双重免疫荧光染色，LC3被兔抗LC3抗体着色，第二抗体显示绿色。同时，神经元细胞被小鼠抗NeuN抗体着色，第二抗体显示红色。合并后激光共聚焦显微镜观察到黄色，表明大多数LC3主要分布于神经元。LC3 Ⅱ蛋白的表达通过Western blot分析发现，sham组LC3Ⅱ蛋白在海马区低水平表达。TBI后6 h的LC3Ⅱ蛋白在海马表达显著增加，24 h后达到最大值。与TBI组比较，Dex组显著抑制6、12、24 h的LC3Ⅱ上调。见图1。

图1 3组LC3和NeuN共定位的双重免疫荧光染色比较

3讨论

海马是一种被广泛研究的与空间记忆相关的结构。数年来，Morris水迷宫已被广泛用于啮齿动物的空间学习能力研究[12]。神经系统程度评分和Morris水迷宫的结果都表明，在脑外伤后单次注射右美托咪啶能显著改善运动和学习功能。这些结果表明右美托咪啶对脑外伤大鼠起到了神经性保护作用。

自噬是细胞在应激时蛋白和细胞器的主要降解过程，是一种自我平衡机制。LC3是自噬诱导的最可靠的生物标志物。作者发现大鼠TBI后从LC3Ⅰ到Ⅱ转化的生化证据。此外，采用免疫组化和激光共聚焦方法研究LC3的分布。共聚焦显微镜下，作者发现损伤海马区神经元的LC3免疫染色增强[13]。免疫印迹分析表明，LC3Ⅱ水平在TBI后6～24 h显著升高。这些结果表明，TBI后自噬被激活。作者先前的研究表明，大鼠海马CA1区神经元损伤后自噬被高度诱导[14]。右美托咪啶能部分抑制创伤引起的LC3Ⅱ免疫反应，表明自噬参与右美托咪啶引起的神经保护。因此，作者推测右美托咪啶对脑损伤的神经保护与海马区自噬抑制相伴。本研究结果表明，右美托咪啶能够抑制神经元的自我吞噬，有效提高受到脑损伤的大鼠海马区神经元的存活率，改善运动和认知功能，从而发挥神经保护的作用。

参考文献

[1]Mammis A, McIntosh TK, Maniker AH. Erythropoietin as a neuroprotective agent in traumatic brain injury: review[J]. Surgical neurology, 2009, 71: 527-531.

[2]Thurman D J, Alverson C, Dunn KA, et al. Traumatic brain injury in the United States: a public health perspective[J]. The Journal of head trauma rehabilitation, 1999, 14: 602-615.

[3]Eghwrudjakpor P O, Allison A. Oxidative stress following traumatic brain injury: enhancement of endogenous antioxidant defense systems and the promise of improved outcome[J]. Niger J Med, 2010, 19: 14-21.

[4]Farag E, Argalious M, Abd-Elsayed A, et al. The use of dexmedetomidine in anesthesia and intensive care: a review[J]. Current pharmaceutical design, 2012, 18: 6257-6265.

[5]Kleinschmidt S. Dexmedetomidin (Dexdor)[J]. Internistische Praxis, 2012, 52: 663-669.

[6]Calisma KB. Effects of Intracisternal and Intravenous Dexmedetomidine on Ischemia-Induced Brain Injury in Rat: A Comparative Study[J]. Turkish neurosurgery, 2013, 23: 208-217.

[7]Sato K, Kimura T, Nishikawa T, et al. Neuroprotective effects of a combination of dexmedetomidine and hypothermia after incomplete cerebral ischemia in rats[J]. Acta Anaesthesiologica Scandinavica, 2010, 54: 377-382.

[8]Eser O, Fidan H, Sahin O, et al. The influence of dexmedetomidine on ischemic rat hippocampus[J]. Brain research, 2008, 1218: 250-256.

[9]Beni-Adani L, Gozes I, Cohen Y, et al. A peptide derived from activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ameliorates injury response in closed head injury in mice[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001, 296: 57-63.

[10]Song S-X, Gao J-L, Wang K-J, et al. Attenuation of brain edema and spatial learning deficits by the inhibition of NADPH oxidase activity using apocynin following diffuse traumatic brain injury in rats[J]. Molecular medicine reports, 2013, 7: 327-331.

[11]Lee B, Sur BJ, Han JJ, et al. Krill phosphatidylserine improves learning and memory in Morris water maze in aged rats[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 2010, 34: 1085-1093.

[12]Sun L, Gao J, Zhao M, et al. The effects of BMSCs transplantation on autophagy by CX43 in the hippocampus following traumatic brain injury in rats[J]. Neurological Sciences, 2013: 1-6.

[13]Cui C, Cui Y, Gao J, et al. Neuroprotective effect of ceftriaxone in a rat model of traumatic brain injury[J]. Neurological Sciences, 2013: 1-6.

Effect of dexmedetomidine on hippocampal neuronal autophagy of rats with traumatic brain injury

GU Zhijie1, ZHANG Manhe2, ZHOU Xiumin2, XING Yanjie2,ZHAO Xin2, ZHANG Shuli2

(1.TheHospitalofLaotingCounty,Laoting,Hebei, 063600; 2.TangshanWorker′sHospital,Tangshan,Hebei, 063000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of dexmedetomidine (Dex) on hippocampal neuronal autophagy of rats with traumatic brain injury (TBI). MethodsThe modified free fall device was used to prepare models of adult SD rats with TBI, and 15 μg/kg Dex was administered immediately after TBI. Motor function was assessed by Neurologic Severity Score (NSS), and the spatial learning ability was evaluated by Morris water maze. The co-localization of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3) and neuronal nuclei (NeuN) was made. Expression of LC3 was detected by Western blot analysis. ResultsCompared with TBI group, the NSS score decreased significantly in Dex group (P<0.05). Compared with sham group, escape latency at 24, 48 h in all rats after TBI increased significantly (P<0.05). Compared with TBI group, escape latency at 48 h significantly decreased in Dex group (P<0.05). Compared with TBI group, the up-regulations of LC3 at 6, 12 and 24 h were significantly inhibited in Dex group (P<0.05). ConclusionApplication of Dex after TBI can significantly improve motor and cognitive functions, inhibit hippocampal neuronal autophagy and promote the recovery of neural function.

KEYWORDS:traumatic brain injury; dexmedetomidine; Morris water maze; autophagy; hippocampus; neural function

中图分类号:R 651.1

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)09-014-03

DOI:10.7619/jcmp.201609004

通信作者:张满和, E-mail: zhangmanhe01@163.com

收稿日期:2015-10-21