MMP-3和TIMP-1在不同类型慢性皮肤溃疡创面表达研究

强燕，肖青青，迮侃，李福伦，马天，李欣，李斌（.上海市松江区中心医院，上海0600；.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海00437）



MMP-3和TIMP-1在不同类型慢性皮肤溃疡创面表达研究

强燕1，肖青青2，迮侃2，李福伦2，马天2，李欣2，李斌2
（1.上海市松江区中心医院，上海201600；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437）

摘要：目的观察基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）蛋白在不同类型慢性皮肤溃疡创面组织中的表达，探讨其病理机制。方法以静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡、压力性溃疡和坏疽性脓皮病患者及正常皮肤志愿者为研究对象，通过免疫组化法检测MMP-3和TIMP-1蛋白在不同类型慢性皮肤溃疡创面组织中的表达和分布规律。结果免疫组化显示：MMP-3和TIMP-1蛋白均呈核表达，相比正常皮肤，静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡和压力性溃疡MMP-3表达显著升高（P＜0.05）；相比血管炎性溃疡，静脉曲张性溃疡、压力性溃疡、坏疽性脓皮病和正常皮肤组织TIMP-1表达均降低（P＜0.05）。结论MMP-3和TIMP-1蛋白在不同类型慢性皮肤溃疡创面组织中表达存在差异：静脉曲张性溃疡和压力性溃疡创面组织中，MMP-3表达上调，TIMP-1表达下调；在血管炎性溃疡创面组织中TIMP-1表达上调。

关键词：皮肤溃疡；创面修复；基质金属蛋白酶-3；基质金属蛋白酶抑制剂-1

压力性溃疡、糖尿病溃疡、静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡等许多慢性皮肤溃疡是临床常见病、多发病，具有病因复杂，病程长，愈后容易复发，治疗费用高等特点，严重影响了患者的生活质量，给家庭和社会带来了沉重的经济负担，已日益成为影响人民群众健康的重要问题之一。

慢性皮肤溃疡创面修复涉及诸多因素。近来国内外研究表明，基质金属蛋白酶（Matrixmeta11oproteinases，MMPs）是参与细胞外基质（Extrace11u1ar matrix，ECM）降解的主要酶蛋白家族，在伤口愈合、血管增生等正常生理过程中，参与基质蛋白的细胞外降解和分解，促使细胞穿越基底膜。ECM与创面成纤维细胞、角质形成细胞、增殖、迁移，以及毛发再生等关系密切，ECM的变化与重构，多种基质降解酶及其抑制酶的共同作用其蛋白水解是创面修复的关键［1-2］。基质金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of meta11oproteinases，TIMPs）能特异性地抑制MMPs家族的活性，两者之间的动态平衡对创面修复起着至关重要作用［3］。本研究从ECM重构角度，运用免疫组化法测定不同类型慢性皮肤溃疡患者创面组织中MMP-3和TIMP-1蛋白表达，分析、探讨上述蛋白参与慢性皮肤溃疡的病理过程，为进一步临床干预和治疗提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

1.1.1诊断标准参考普通高等中医药类规划教材七版《中医外科学》、国家中医药管理局1994-6-28发布的中华人民共和国中医药行业标准ZY/ T001 1-001.9-94、《中医证候鉴别诊断学》（人民卫生出版社，2002年9月版）和《中药新药临床研究指导原则》（中国医药科技出版社，2002年5月版）制定标准：慢性皮肤溃疡：皮肤破溃病程大于1个月。

1.1.2纳入标准（1）符合诊断标准；（2）年龄≥18周岁且≤85周岁，男女不限；（3）疮面面积≥1cm2，病程超过1个月；（4）知情同意，签署知情同意书，并自愿受试。

1.1.3排除标准（1）不符合诊断标准和纳入标准者；（2）妊娠或哺乳期妇女；（3）合并心脑血管、肝、肾、造血系统等原发性疾病，精神病患者；（4）合并严重感染者，结核病及创面局部有癌变（病理证实）倾向者。

1.1.4病例来源2011年1月—2013年12月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院、上海市松江区中心医院门诊及住院具有完整病史的慢性难愈性皮肤溃疡患者：静脉曲张性溃疡5例、血管炎性溃疡、压力性溃疡和坏疽性脓皮病各4例。4例正常皮肤源于正常志愿者。

1.2方法

1.2.1临床标本采集分别采集4种类型慢性皮肤溃疡创面标本和正常皮肤样本，经福尔马林固定24 h后，乙醇梯度脱水、石蜡包埋，5 μm厚连续切片，用于免疫组化。

1.2.2主要试剂、仪器及设备抗体：MMP-3购于EPITMICS公司，TIMP-1购于Stanta Cruz Biotechno1ogy公司。仪器及设备：Leica超薄切片机（Jung RM2015，Leica）上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院病理科提供；ImageJ 1.42q图像分析软件；OLYMPUS BH2显微镜；NIKON数码相机。

1.2.3MMP-3、TIMP-1免疫组化检测按照SABC免疫组化试剂盒说明书进行。石蜡切片常规脱蜡水化；甲醇50﹕1H2O2灭活内源性过氧化物酶，室温避光10min；切片经ddH2O冲洗后，置于0.01mo1/L枸橼酸钠溶液微波加热“3-5-3”法，进行抗原修复；切片自然冷却至室温，PBST浸泡5min，PBS冲洗2min×3次，分别滴加抗MMP-3和TIMP-1单克隆抗体，4℃冰箱过夜；次日PBST再次洗涤2min×3次；滴加二抗生物素，室温孵化30min；显微镜下DAB显色，阳性反应为切片中出现黄褐色显影，蒸馏水冲洗，终止反应。苏木精衬染，中性树胶封固。已知阳性切片为阳性对照，以1×PBS代替血清为阴性对照。

1.2.4结果检测免疫组化染色阳性反应为黄棕色颗粒且明显高于背景染色。2人双盲法观察切片，在10×40倍光镜下观察10个阳性细胞较多的视野，计算其平均数，每个视野计数100个细胞，共计1000个细胞。根据染色阳性细胞占细胞的百分比，将结果分为：染色阳性细胞占细胞总数1%～10%为+，11%～50%为++，51%～75%为+++，大于75%为++++。

1.3统计学处理采用SPSS 14.0 for Windows软件进行统计。定性资料采用卡方检验或精确概率法。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值，以P＜0.05作为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MMP-3蛋白在不同类型患者创面中的表达实验通过对静脉曲张性溃疡见图1，血管炎性溃疡见图2，压力性溃疡见图3，坏疽性脓皮病患者创面组织见图4，正常皮肤组织见图5。进行MMP-3免疫组化检测发现：MMP-3蛋白主要定位在表皮棘层鳞状上皮和创面愈合组织增生的皮肤全层，棕黄色颗粒主要位于细胞核，即呈核表达，正常组织真皮、皮下组织未见表达。不同组织MMP-3表达差异有统计学意义（P＜0.05）：正常皮肤组织中MMP-3蛋白表达呈阴性（阳性率0%），显著低于静脉曲张性溃疡（阳性率100%）、血管炎性溃疡（阳性率75%）和压力性溃疡（阳性率100%）。见表1。

2.2TIMP-1蛋白在不同类型患者创面中的表达实验通过对静脉曲张性溃疡见图6，血管炎性溃疡见图7，压力性溃疡见图8，坏疽性脓皮病患者创面组织见图9及正常皮肤组织见图10。进行TIMP-1免疫组化检测发现：TIMP-1蛋白主要定位在表皮棘层鳞状上皮和创面愈合组织增生的皮肤全层，棕黄色颗粒主要位于细胞核，即呈核表达，正常组织真皮、皮下组织未见表达。免疫组化结果与TIMP-1为MMPs家族抑制剂预期基本相符。不同组织TIMP-1表达差异有统计学意义（P＜0.05）：血管炎性溃疡创面组织中TIMP-1蛋白表达呈强阳性（阳性率100%），高于静脉曲张性溃疡（阳性率60%）、压力性溃疡（阳性率50%）、坏疽性脓皮病（阳性率25%）和正常皮肤组织（阳性率75%）。见表2。

表1　MMP-3蛋白在不同类型创面中的表达例

表2　TIMP-1蛋白在不同类型患者创面中的表达例

3　讨论

图1　MMP3蛋白在静脉曲张性溃疡创面组织的表达

图2　MMP3蛋白在血管炎性溃疡创面组织的表达

图3　MMP3蛋白在压力性溃疡创面组织的表达

图4　MMP3蛋白在坏疽性脓皮病创面组织的表达

图5　MMP3蛋白在正常皮肤组织的表达

图6　TIMP-1蛋白在静脉曲张性溃疡创面组织的表达

图7　TIMP-1蛋白在血管炎性溃疡创面组织的表达

图8　TIMP-1蛋白在压力性溃疡创面组织的表达

图9　TIMP-1蛋白在坏疽性脓皮病创面组织的表达

图10　TIMP-1蛋白在正常皮肤组织的表达

MMP-3也称基质溶素-1（Strome1ysin-1）或前明胶酶（Proge1atinase），属于MMPs家族中基质降解酶，对Zn2+依赖的蛋白酶。MMP-3能够降解多种ECM成分，参与组织形态发生、创面修复、炎症反应等生理、病理过程，其水解底物包括Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型胶原，蛋白聚糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，是一种重要的细胞外基质调节酶［3］。MMPs的激活是导致ECM降解的关键步骤，MMP-3能通过水解各种ECM成分而激活其他的MMPs（如MMP1、7、8、13等）［4-5］，因而被认为其在MMPs的生物活性中起始动作用，进而在创伤修复的基质重构中发挥重要功能。MMP-3的表达可见于组织创伤后的不同时间段，有研究显示甚至在创伤后28d仍可检测到MMP-3的表达［6］，表明MMP-3不仅参与了ECM降解，而且也与创面修复、ECM重塑和组织改建密切相关。本研究证实，相比正常皮肤组织，静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡和压力性溃疡MMP-3表达显著升高（P＜0.05），表明静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡和压力性溃疡病理状态下，创面组织MMP-3活性显著增加。

TIMPs是一组低分子质量的蛋白，广泛分布于组织和体液中，可由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等产生。目前报道的TIMPs家族成员至少有4种：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4。TIMPs是组织中MMPs主要的内源性抑制因子，能特异性抑制MMPs家族的基质降解酶。有研究发现，TIMP-1能被多种细胞因子诱导产生，以可逆的非共价键形式按1﹕1比例与MMP-3结合成复合物，TIMP-1可抑制几乎所有MMPs，尤其是MMP-9的活性［7-8］，而由于MMPs间存在交叉激活现象，MMP-3是pro-MMP-9最有效和体内天然的活化剂，因此在炎症过程中，MMP-9的激活依赖于MMP-3，当pro-MMP-9与TIMP-1结合成复合物时，则能激活某些基质，进而特异性、可逆性抑制其活性，使ECM处于动态平衡中。此外，TIMPs是多功能分子，不仅具有细胞生长因子样作用，还有促进成纤维细胞增生及胶原合成使ECM沉积并抑制其降解，调控ECM代谢和抑制血管的生成等作用。而细胞因子、生长因子和激素则通过复杂的途径调节MMPs及其相应的TIMPs的表达。有研究发现MMP-3可激活白细胞介素-1β（IL-1β）活性的调节，反之这些酶也能使细胞因子失活［9］，因此，MMP-3可能参与慢性炎症中IL-1β活性调节进而影响创伤愈合延迟或纤维化等。本研究证实，相比血管炎性溃疡，静脉曲张性溃疡、压力性溃疡和坏疽性脓皮病TIMP-1表达均显著降低（P＜0.05），提示血管炎性溃疡创面修复过程中ECM的积聚、沉积得到抑制，可能是其难以愈合的因素之一。

尽管MMP-3和TIMP-1在慢性皮肤溃疡中相互关系已有诸多研究报道，但是本研究对不同类型慢性皮肤溃疡进行分类，观测其表达差异，从而为进一步临床干预和治疗提供理论依据，指导临床治疗提供科学依据。本研究证实了MMP-3与TIMP-1在不同类型慢性皮肤溃疡创面组织中存在差异：静脉曲张性溃疡和压力性溃疡创面组织中，MMP-3上调，TIMP-1表达下调；而在血管炎性溃疡创面组织中TIMP-1表达上调，与Cook等［10］体外研究的急性溃疡创面的表达一致，王一飞等［11］在进一步研究中医药祛瘀生肌法对糖尿病大鼠皮肤溃疡模型的调控机制研究中，亦证实了使用不同比例的祛瘀生肌中药组方能够调控MMP-3和T1MP-1的之间的平衡。综上所述，研究MMP-3及其组织抑制剂TIMP-1的平衡调节机制，将有助于进一步临床治疗干预，提高创面修复质量。

参考文献：

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·论著·

资助项目：1.国家中医药管理局资助“十二五”中医药重点学科—中医皮肤病学；2.国家中医药管理局资助“十二五”重点专科—皮肤科；3.上海市科学技术委员会项目，NO.12401903500，16QA1403800；4.上海市卫计委中医药事业发展三年行动计划ZY3-CCCX-1-1008，ZYSNXD-CC-ZDYJ018；5.国家自然基金项目（81373648）；6.上海市松江区公共卫生合作科研项目2014-11

Expression of MMP-3 and TIMP-1 in Skin Lesions of Chronic Cutaneous Ulcers

Qiang Yan1，Xiao Qingqing2，Ze Kan2，Li Fulun2，Ma Tian2，Li Xin2，Li Bin2
1.Central Hospital of Songjiang District，Shanghai 201600，China；2.Yueyang Hospital of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai TCM University，Shanghai 200437，China

Abstract：Objective In order to compare the expression and distribution patterns of matrix meta11oproteinases-3（MMP-3）and tissue inhibitor of meta11oproteinases-1（TIMP-1），and to investigate the patho1ogica1 mechanism in different subtypes of chronic cutaneous u1cers. Methods Using immunohistochemistry to detect the expression and distribution patterns of MMP-3 and TIMP-1 in skin 1esions of varicose u1cer，vascu1itic u1cer，pressure u1cer，pyoderma gangrenosum and hea1th contro1. Results Immunohistochemistry tests showed MMP-3 and TIMP-1 expressed in nuc1ei. The expression of MMP-3 in varicose u1cer，vascu1itic u1cer and pressure u1cer were significant1y higher than that in hea1th contro1s（P＜0.05）. The expression of TIMP-1 in varicose u1cer，pressure u1cer，pyoderma gangrenosum and hea1th contro1 were significant1y 1ower than that in vascu1itic u1cer（P＜0.05）. Conclusion MMP-3 and TIMP-1 expression are different between skin 1esions of different chronic cutaneous u1cers. In varicose u1cer and pressure u1cer，the expression of MMP-3 are increased，the expression of TIMP-1 are decreased；in vascu1itic u1cer，the expression of TIMP-1 is increased.

Key words：Cutaneous u1cers；Wound repair；Matrix meta11oproteinases-3；Tissue inhibitor of meta11oproteinases-1

收稿日期：（2016-01-03）

通信作者：李欣，E-mail：13661956326@163.com

中图分类号：R751.05

文献标识码：A

文章编号：1672-0709（2016）02-0074-05