308nm准分子激光治疗前后对寻常型银屑病患者外周血Th17/Treg细胞免疫失衡的研究

陆家睛，丁杨峰，于宁，陈福娟，张怡，易雪梅（上海市皮肤病医院，上海200443）



308nm准分子激光治疗前后对寻常型银屑病患者外周血Th17/Treg细胞免疫失衡的研究

陆家睛，丁杨峰，于宁，陈福娟，张怡，易雪梅
（上海市皮肤病医院，上海200443）

摘要：目的探讨308nm准分子激光治疗前后寻常型银屑病患者外周血Th17细胞与Treg细胞的比例、Th17/Treg比值，分析308nm准分子激光治疗前后Th17/Treg细胞免疫失衡与银屑病发病及病情严重程度之间的关系。方法选取60例寻常型银屑病患者作为试验组，同时选20例健康人作为正常对照组，采用流式细胞术检测寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前后及正常人外周血Th17细胞和Treg细胞的比例、Th17/Treg的比值，同时以银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分评价寻常型银屑病患者病情的严重程度。结果寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前外周血Th17细胞的比例、Th17/Treg比值显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Treg细胞的比例显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后外周血Th17细胞的比例、Th17/Treg比值显著低于治疗前（P＜0.01）；Treg细胞的比例显著高于治疗前（P＜0.01）。寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后外周血Th17细胞的比例、Treg细胞的比例、Th17/Treg比值与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。寻常型银屑病患者PASI评分与Th17细胞的比例呈正相关（P＜0.01）；而Treg细胞的比例与疾病严重程度之间无相关性（P＞0.05）。结论Th17/Treg细胞免疫失衡可能对银屑病的发病至关重要，308nm准分子激光治疗可望通过调节患者外周血Th17细胞与Treg细胞的比例，从而调节Th17/Treg细胞失衡达到治疗银屑病的目的。

关键词：银屑病；308nm准分子激光；Th17/Treg细胞免疫失衡

Th17细胞是近年来发现的一种新型CD4+T细胞亚群，主要通过分泌白细胞介素-17A（IL-17A）、IL-17F、IL-22等细胞因子而参与银屑病的发生与发展［1］。调节性T细胞（Treg）是一种具有免疫调节功能的T细胞亚群，对维持机体免疫耐受和相关免疫应答的稳态作用匪浅。因此Th17/Treg细胞失衡可能在一定程度上对自身免疫性疾病的调控也起着不可或缺的作用［2］。308nm准分子激光即氯化氙（XeC1）准分子激光，具有可调的靶向性良好的光斑，只针对银屑病的皮损，克服了紫外线对正常皮肤的不良影响，在加大剂量、加快疗程的同时可大大减少不良反应［3］。本研究通过检测寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前后外周血Th17/Treg细胞的表达水平，探讨Th17/Treg细胞免疫失衡与银屑病发病及病情严重程度之间的关系，及308nm准分子激光治疗银屑病的机制。

1　对象与方法

1.1病例资料本研究为开放性研究，所选患者来自2013年1月—2015年1月我院皮肤内科门诊及病房患者，根据适应证，确立入选标准、排除标准及剔除标准，筛选寻常型银屑病60例，年龄18～70岁，平均（47.30±16.32）岁，病程1个月～20年，平均（5.04±3.81）年；银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分1.23～7.69，60例患者平均（4.68±1.26）分。筛选正常健康人20例作为对照组，年龄18～70岁，平均（47.15±14.70）岁。2组在性别、年龄上差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。试验组与对照组均签署知情同意书。

1.1.1适应证符合寻常型银屑病诊断标准，且皮损面积小于体表面积的5%的厚斑块患者（非点滴型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病和红皮病型银屑病）。

1.1.2入选标准①临床上诊断为寻常型银屑病诊断标准，且皮损面积小于体表面积的5%的厚斑块患者。②年龄18～70岁，性别不限。③无严重的心脑血管器质性病变及肝、肾功能损害者。④无免疫功能低下者。⑤已签署知情同意书的患者。

1.1.3排除标准①患者有光敏性皮肤病以及可能因光照射诱发或加重的疾病等；②近1周有服用光敏性药物；③有恶性皮肤肿瘤史者；④孕妇及哺乳期妇女；⑤合并有精神、神经疾患者；⑥有不宜入选的其他原因。

1.4剔除标准①未按照治疗方案治疗者；②入选后发现不符合入选标准或符合排除标准；③入组后无任何随访记录者。

1.5评分标准①红斑（E）：0=无（无红斑可见），1=轻度（呈淡红色），2=中等度（红色），3=重度（深红色），4=极重度（红色极深）；②鳞屑（S）：0=无（表面无可见鳞屑），1=轻度（部分皮损表面上覆有鳞屑，以细微的鳞屑为主），2=中等度（大多数皮损表面完全或不完全覆有鳞屑，鳞屑呈片状），3=重度（几乎全部皮损表面覆有鳞屑，鳞屑较厚成层），4=极重度（全部皮损表面均覆有鳞屑，鳞屑很厚成层）；③浸润程度（T）：0=无（皮损与正常皮肤平齐），1=轻度（皮损轻微高出于正常皮肤表面），2=中等度（中等度隆起，斑块的边缘为圆或斜坡形），3=重度（皮损肥厚，隆起明显），4=极重度（皮损高度增厚，隆起极为明显）。

各部位PASI得分的计算公式是：

PASI（头部）=0.1（红斑+浸润+脱屑）×皮损面积；

PASI（上肢）=0.2（红斑+浸润+脱屑）×皮损面积；

PASI（躯干）=0.3（红斑+浸润+脱屑）×皮损面积；

PASI（下肢）=0.4（红斑+浸润+脱属）×皮损面积；

PASI总分=PASI（头部）+PASI（上肢）+PASI（下肢）+PASI（躯干）。

1.2方法

1.2.1308nm准分子激光照射试验组给予308nm准分子激光局部照射2次/周，照射前测定MED，患者初始剂量为1倍的MED，每次剂量均在前次照射剂量的基础上增加10%～25%，如果局部出现明显红斑，则减少前次照射剂量的10%；如出现痛性红斑或水疱则停止照射1次或2次。疗程为10次，如照射部位痊愈则停止照射308nm准分子激光。

1.2.2观察时间每周1次，随访5次。

1.2.3观察内容①每周1次治疗前研究者对患者疾病严重程度进行评分；②每周1次治疗前研究者对患者治疗的靶部位拍照；③观察记录不良反应；④预约下次治疗、随访时间。

1.2.4治疗前后流式细胞仪检测试验组和对照组外周血Th17、Treg细胞的比例

①Th17细胞的比例检测：按照文献［5］进行。每例患者和正常人均取静脉血3mL，肝素抗凝，以PBS等体积稀释。采用人淋巴细胞分离液获取外周血单一核细胞（PBMC），RPMI1640调整细胞浓度至2×106/mL，接种至24孔板后加入佛波酯（50μg/L）、离子霉索（1μmo1/L）和莫能霉素（500μg/L），37℃、5%CO2细胞培养箱培养4h。收集细胞根据计数等分为测定管和同型对照管，加入20μLPE标记的鼠抗人CD4单抗，4℃避光孵育30min。PBS洗涤2次，固定液室温避光固定反应20min后离心弃去上清，PBS洗涤2次。加入破膜剂进行细胞打孔利于细胞因子染色，离心弃去上清后予细胞因子染色。测定管加入FITC标志的IL-17A0.5μL，对照管加入同型对照，4℃避光孵育30min。应用流式细胞仪，根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，设置各通道间的荧光补偿后，对Th17细胞的比例进行检测。

②Treg细胞的比例检测：取抗凝全血3mL，加入PE标记的鼠抗人CD4单抗和FITC标记的鼠抗人CD25抗体20μL，IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照，混匀后避光15min，再加入1mL红细胞裂解液。37℃孵育10min。离心弃去上清，PBS洗涤3次后用流式细胞仪检测。

1.3统计学方法采用SPSS17.0版统计软件进行处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验。相关性检验采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1外周血Th17细胞比例

2.1.1寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前Th17细胞检测的流式代表图见图1

2.1.2寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后Th17细胞检测的流式代表图见图2

2.1.3正常对照组Th17细胞检测的流式代表图见图3

图1　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前Th17细胞检测的流式代表图

图2　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后Th17细胞检测的流式代表图

图3　正常对照组Th17细胞检测的流式代表图

2.2外周血Treg细胞比例

2.2.1寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前Treg细胞检测的流式代表图见图4

2.2.2寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后Treg细胞检测的流式代表图见图5

2.2.3正常对照组Treg细胞检测的流式代表图见图6

图4　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前Treg细胞检测的流式代表图

图5　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后Treg细胞检测的流式代表图

图6　正常对照组Treg细胞检测的流式代表图

2.3统计学结果

2.3.1外周血Th17细胞、Treg细胞的比例、Th17/Treg比值检测结果比较寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前外周血Th17细胞的比例和Th17/Treg比值均显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Treg细胞的比例显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后外周血Th17细胞的比例和Th17/Treg比值显著低于治疗前患者，差异有统计学意义（P＜0.01）；Treg细胞的比例显著高于治疗前患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后外周血Th17细胞的比例、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值及正常对照组外周血Th17细胞的比例、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前后与正常对照组Th17/Treg细胞比较　　（±s）

表1　寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗前后与正常对照组Th17/Treg细胞比较　　（±s）

注：t为试验组（治疗前）与对照组比较，P为试验组（治疗前）与对照组比较；t1为治疗前与治疗后比较，P1为治疗前与治疗后比较；t2为试验组（治疗后）与对照组比较，P2为试验组（治疗后）与对照组比较。

组别　n　 Th17（%）　Treg（%）　Th17/Treg试验组（治疗前）　60　 2.20±0.96　 0.74±1.01　 6.20±13.75试验组（治疗后）　60　 1.07±0.87　 2.16±1.42　 0.61±0.66对照组　20　 0.40±0.37　 3.49±1.65　 0.13±0.12 t 17.86　5.63　3.49 t1　11.97　12.2　3.22 t2　9.49　11.97　7.24 P 0.0037　 0.0033　 0.0013 P1　0.0046　 0.0041　 0.0017 P2　0.0728　 0.0601　 0.0731

2.3.2Th17/Treg细胞与PASI评分的相关性分析本研究中所选寻常型银屑病患者PASI评分为（4.68±1.26）分。寻常型银屑病患者PASI评分与Th17细胞的比例呈正相关（r=0.871，P＜0.01）；而Treg细胞的比例与疾病严重程度之间无相关性（r=-0.023，P＞0.05）。

3　讨论

目前普遍认为，Th17细胞和Treg细胞是初始CD4+T细胞在不同条件下分化而成的两种T细胞亚群［7］，而银屑病是以T淋巴细胞为主介导的免疫异常性疾病，Th17细胞通过分泌IL-17在银屑病发病中起更为直接的作用［8］。Treg细胞是一类同时具有免疫调节和免疫抑制双重作用的CD4+T细胞，能调控免疫应答强度，削弱致病因素对机体产生的影响［9］。若因其细胞的数量、功能不足，本身的可塑性改变，亦或是炎症因子及效应性T细胞的抵抗作用，使其不能有效地发挥抑制功能，则严重影响银屑病的预后［10］。由此，介导自身免疫性疾病的Th17细胞与维持自身免疫耐受的Treg细胞两者之间存在着平衡，此平衡对维持机体免疫稳态起着重要的作用［11］，一旦这种平衡被打破，可导致自身免疫性疾病的发病［12］。Th17细胞、Treg细胞及Th17/Treg细胞的平衡与银屑病发生发展之间的关系已成为人们关注的焦点［13］。

308nm准分子激光用于治疗银屑病的机制可能与T淋巴细胞凋亡有关［14］。目前研究显示，经过308nm准分子激光治疗，原皮损不仅在肉眼水平上完全消失，而且在微观水平上的组织结构也趋于正常，免疫组化研究显示该激光能够基本消除皮损处浸润的效应性T淋巴细胞［14］。另外Mavi1ia等［15］用308nm准分子激光治疗银屑病患者，发现当病情稳定后，部分细胞因子在皮损和正常皮肤中的表达水平基本相同。由此说明308nm准分子激光可通过抑制细胞因子的产生，从而达到治疗银屑病的效果。

本研究结果显示308nm准分子激光治疗前寻常型银屑病患者外周血Th17细胞的比例显著高于正常对照组，并与PASI评分呈正相关，说明Th17细胞与银屑病的致病密切相关，其可望成为评估银屑病严重程度的指标。Treg细胞的比例显著低于正常对照组，提示银屑病患者Treg细胞可能不同程度地受损，导致其不能有效地抑制效应T细胞介导的免疫反应，从而引起银屑病病情加重。308nm准分子激光治疗前寻常型银屑病患者Th17/Treg比例显著高于正常对照组，表明银屑病患者体内存在着Th17/Treg细胞表达失衡的情况，这可能是银屑病免疫发病机制的中心环节，若对其进行相应地调节将成为银屑病治疗的关键。此外，该研究还发现308nm准分子激光治疗后寻常型银屑病患者外周血Th17细胞的比例、Th17/Treg比值显著低于治疗前，而Treg细胞的比例显著高于治疗前，说明308nm准分子激光在治疗皮损的同时，可望通过调节患者外周血Th17细胞与Treg细胞的比例，从而调节Th17/Treg细胞失衡达到治疗银屑病的目的。而寻常型银屑病患者308nm准分子激光治疗后外周血Th17细胞的比例、Treg细胞的比例、Th17/Treg比值与正常对照组比较，差异无统计学意义，说明通过308nm准分子激光对皮损处的治疗，能有效地使致病T细胞凋亡，充分调动Treg细胞抑制免疫反应的功能，从而可望成为治疗银屑病的有效靶点。

综上所述，若银屑病患者Th17细胞异常活化，导致Th17细胞中的IL-23/Th17细胞轴、Th17相关细胞因子的异常表达，使致病细胞总体功能占优势；而Treg细胞由于各种原因使其不能有效地发挥抑制Th17细胞的功能，是诱发银屑病的关键因素。故探讨银屑病中Th17和Treg细胞的相互调节机制，研究银屑病患者308nm准分子激光治疗前后在调控Th17/Treg细胞表达失衡中的作用，从一定程度上可成为银屑病治疗的靶点。

参考文献：

［1］Kagami S，Rizzo HL，Lee JJ，et a1. Circu1ating Th17，Th22，and Th1 ce11s are increased in psoriasis［J］. J Invest Dermato1，2010，130：1373-1383.

［2］Cheng X，Yu X，Ding YJ，et a1. The Th17/Treg imba1ance in patients with acute coronary syndrome［J］. C1in Immuno1，2008，127：89-97.

［3］Mehraban S，Fei1y A. 308 nm excimer 1aser in dermato1ogy［J］. J Lasers Med Sci，2014，5：8-12.

［4］Gunda P，Syeda SS，Jug1 SM. Understanding the re1ationship between hea1th assessment questionnaire-disabi1ity indes（HAQDI），psoriasis area severity indes（PASI），and qua1ity of 1ife（QOL）and its inf1uence on cost-effectiveness in psoriatic arthritis（PSA）［J］. Va1ue Hea1th，2015，18：A653.

［5］Wu WZ，Zhang FR. G1ycyrrhizin combined with acitretin improve c1inica1 symptom of psoriasis via reducing Th17 ce11 differentiation and re1ated serum cytokine concentrations［J］. Int J C1in Exp Med，2015，8：16266-16272.

［6］Lochner M，Wang Z，Sparwasser T. The specia1 re1ationship in the deve1opment and function of T he1per 17 and regu1atory T ce11s［J］. Prog Mo1 Bio1 Trans1 Sci，2015，136：99-129.

［7］Visekruna A，Huber M，He11hund A，et a1. c-Re1 is crucia1 for the inductionofFoxp3（+）regu1atoryCD4（+）Tce11sbutnotTh17ce11s［J］. Eur J Immuno1，2010，40：671-676.

［8］Liu Y，Su L，Lin Q，et a1. Induction of C-Mip by IL-17 p1ays an important ro1e in adriamycin-induced podocyte damage［J］. Ce11 Physio1 Biochem，2015，36：1274-1290.

［9］Littman DR，Rudensky AY. Th17 and regu1atory T ce11s in mediating and restraining inf1ammation［J］. Ce11，2010，140：845-858.

［10］Bettini M，Vigna1i DA. Regu1atory T ce11s and inhibitory cytokines in autoimmunity［J］. Curr Opin Immuno1，2009，21：612-618.

［11］Kimura A，Kishimoto T. IL-6：regu1ator of Treg/Th17 ba1ance［J］. Eur J Immuno1，2010，40：1830-1835.

［12］Wing K，Sakaguchi S. Regu1atory T Ce11s exert checks and ba1ances on se1f to1erance and autoimmunity［J］. Nature Immuno1，2010，11：7-13.

［13］Quag1ino P，Berga11o M，Ponti R，et a1. Th1，Th2，Th17 and regu1atory T ce11 pattern in psoriatic patients：modu1ation of cytokines and gene targets induced by etanercept treatment and corre1ationwithc1inica1response［J］. Dermato1ogy，2011，223：57-67.

［14］Rodewa1d EJ，Housman TS，Me11en BG，et a1. The efficacy of 308nm 1aser treatment of psoriasis compared to historica1 contro1s［J］. Dermato1 On1ine J，2001，7：4.

［15］Mavi1ia L，Campo1mi P，Rossi R，et a1. Wide-area 308 nm phototherapywith non1aser 1ight in the treatment of psoriasis：resu1ts of a pi1ot study［J］. Br J Dermato1，2005，152：1376-1377.

·论著·

资助项目：上海市科委课题（12411951702）和上海市卫生局课题（20124126）

Imbalance of the Peripheral Blood Th17/Treg Cells in Patients with Psoriasis Vulgaris before and after the 308 nm Excimer Laser

Lu Jiajing，Ding Yangfeng，Yu Ning，Chen Fujuan，Zhang Yi，Yi Xuemei
Shanghai Skin Diseases Hospital，Shanghai 200443，China

Abstract：Objective In order to investigate the quantity of peripheral bloodThelper 17（Th17） and regulatory T（Treg） cells and the ratio of Th17/Treg in psoriasis vulgaris before and after the 308 nm excimer laser in order to analyze the role of Th17/Treg imbalance in the pathogenesis of psoriasis and its relationship with the disease severity. Methods Peripheral bloods were collected from 60 patients with psoriasis vulgaris and 20 normal human controls. The percentage of Th17 and Treg cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg were determined by flow cytometry. Meanwhile the psoriasis area and severity index（PASI） scores was used to assess the disease severity in patients with psoriasis vulgaris. Results Compared with normal human controls， patients with psoriasis vulgaris before the 308 nm excimer laser showed higher level of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg （P＜0.01）， but the percentage of Treg cells was significantly lower （P＜0.01）. Patients with psoriasis vulgaris after the laser treatment showed lower level of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg compared with those before treatment（P＜0.01）， but the percentage of Treg cells was significantly higher （P＜0.01）. Compared with normal human controls， the ratio of Th17/Treg and the percentage of Th17 and Treg cells in patients with psoriasis vulgaris after the 308 nm excimer laser showedno statistically significant difference （P＞0.05）. The PASI score inpatients withpsoriasisvulgariswas positively correlated with the percentage of Th17 （P＜0.01）， but the percentage of Treg cells were unrelated to the PASI score （P＞0.05）.Conclusion The imbalance between Th17 and Treg cells may play an important role in the pathogenesis of psoriasis. Regulating the percentageofTh17 and Treg cells in peripheral bloodthrough308nmexcimer laser andtherebalance of the Th17/Treg cellsmay become anovel treatment of psoriasis.

Key words：Psoriasis；308 nm excimer 1aser；Th17/Treg imba1ance

收稿日期：（2015-07-28）

通信作者：易雪梅，E-mail：xuemei_yi@aliyun.com

中图分类号：R758.63

文献标识码：A

文章编号：1672-0709（2016）02-0069-06