高效液相色谱法测定不同品种番木瓜果实中维生素C含量

谢轶 苏冰霞 周鹏

摘 要 通过优化实验条件，使用高效液相色谱法对海南省种植范围较广的几种番木瓜（中白、大青、小青）维生素C（Vc）含量进行测定。选取3个番木瓜品种成熟果实，通过HPLC方法测定Vc的标准溶液线性、精密度、回收率等，并比较该法与国标方法的重复性。结果显示，获得线性回归方程y=35.41x-4.16（r=0.999），Vc在 60～300 μg/mL 的浓度范围线性关系良好，方法回收率为98.56%～103.21%，精密度RSD为0.69%；测得中白、大青、小青果肉Vc含量分别为49.12、43.38、46.31 mg/hg。HPLC法结果重现性RSD为0.68%；2，6-二氯靛酚滴定法结果重现性RSD为5.45%，表明HPLC法是检测番木瓜等深颜色水果Vc含量可靠的方法。

关键词 番木瓜 ；维生素C ；高效液相色谱

分类号 S668.2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.010

An Optimized HPLC Method for Analyzing

Vc Content in Different Breeds of Papaya

XIE Yi1，2） SU Bingxia1，2） ZHOU Peng1，2）

（1 Analysis & Testing Center， CATAS，Haikou，Hainan 571101；

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，

Haikou， Hainan 571101）

Abstract In order to develop an optimal method for isolating and analyzing Vc in breeds of papaya which were widely planted. extracting solution，chromatographic conditions were improved and optimized on the basis of former reported High Performance Liquid Chromatography（HPLC） methods. The results showed that The calibration curves of Vc was in good linearity over the ranges of 60～300 μg/mL（r=0.999）， and the average recovery rates was 100.75% （RSD=0.69%）. The content of Vc in "Zhongbai"，"Daqing"， "Xiaoqing" is 49.12， 43.38， 46.31 mg/100 g. The method of HPLC is better in repeatability（RSD=0.68%） than 2，6-dichlorindophenol titration（RSD=5.45%）. Therefore HPLC could be used for the determination of Vc in papaya and other fruits which had high level of Vc.

Keywords papaya ； Vc ； HPLC

维生素C是维持人体生理机能的重要营养素，是人体需求量最大而又自身无法合成，必须从外界摄取的一类维生素。研究表明，Vc还具有抗癌、抗氧化作用[2-3]。番木瓜中维生素C的含量是苹果的20～30倍[1]，半个中等大小的番木瓜足以供成人整天所需的维生素C。因此，准确测定番木瓜中Vc含量，对番木瓜资源的开发利用有十分重要的意义。

传统的紫外分光光度分析法[4]、碘量法[5]、2，4-二硝基苯肼比较法[6]等存在操作繁琐、费时、结果不准确等问题，常用的国标方法（2，6-二氯靛酚滴定法）对深色水果突变终点显色不明显，造成结果误差大等问题。用高效液相色谱法测定水果中 Vc 含量已较为常见[7-9]。本研究采用HPLC方法检测3种番木瓜Vc含量，并用2，6-二氯靛酚滴定法对该法的结果重现性进行比对，建立了较为快速准确的测定番木瓜Vc含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

METTLER TOLEDO 电子天平；Waters alliance e 2695液相色谱仪；Waters XBridge C18色谱柱。

1.1.2 试剂

Vc 标准品（分析纯含量>99.0%，上海生工生物工程公司）；草酸、偏磷酸（MPA）均为分析纯；水为去离子水；2，6-二氯靛酚钠、白陶土（上海华蓝化学科技有限公司）；新鲜番木瓜（基地采样）。

1.2 方法

1.2.1 Vc标准溶液制备

精确称取Vc对照品100 mg于 50 mL 棕色容量瓶中，用0.1% 草酸流动相定容，配成 2 000 μg/mL 的对照品溶液，待用。

1.2.2 供试品溶液的制备

将各品种番木瓜去皮、去籽，分别取50 g果肉，加50 mL 2%草酸浸提剂，迅速研磨成匀浆，用布氏漏斗过滤后置于100 mL容量瓶中，定容，最后用0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。2，6-二氯靛酚滴定法制样参见国家标准[1]。

1.2.3 色谱条件

HPLC色谱柱：Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1% 草酸溶液；流速：1 mL/min；柱温：30℃；紫外检测器检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

1.2.4 线性关系测定

分别准确吸取 Vc 对照品溶液 1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL于50 mL 棕色容量瓶中，用流动相溶液将其稀释至刻度，摇匀，分别配成 60、120、180、240、300 μg/mL的标准系列溶液。按“1.2.3”中色谱条件，采用HPLC法测定各标准液的峰面积，记录色谱图。

1.2.5 “中白”样品测定

取同批“中白”供试品溶液，按“1.2.3”的色谱条件连续进样 6 次，采用HPLC法检测。

1.2.6 方法重复性比对

HPLC法重复性测定：取同批“中白”番木瓜样品，按照“1.2.2”的制样方法制备供试品溶液，准确称5份，按“1.2.3”的色谱条件测定，通过计算 RSD来考查其方法的重复性。

2，6-二氯靛酚滴定法重复性测定：具体操作方法参见国家标准[1]。

1.2.7 回收率测定

用移液器吸取等量“中白”样品溶液至相应编号的容量瓶中，在已知浓度的样品中分别准确加入50、100、150、200、250 μg的标准品，采用HPLC法依次进行峰面积测定。

1.2.8 提取液的选择

取5份“中白”番木瓜并分为2组，分别以2%草酸和2%偏磷酸作为样品提取液，参照“1.2.2”的方法制样；检测方法参照“1.2.3”，分别以0.1%草酸[10]和0.2%MPA[11]作为流动相测定Vc含量。

1.2.9 3个番木瓜品种的Vc含量

通过实地调研，选取海南普遍种植的3个番木瓜品种（中白、大青、小青），从海南昌江、东方、三亚基地分别摘取这3个品种的成熟番木瓜，按照“1.2.2”方法，分别制得6份待测样品，按照“1.2.3”的色谱条件，用HPLC法检测。

2 结果与分析

2.1 线性关系分析

以峰面积对浓度求回归方程和相关系数，结果见图1。得到线性回归方程y=35.41x-4.16（r=0.999），Vc含量在 60～300 μg/mL 的浓度范围内线性关系良好。

2.2 样品测定及精密度

由表1可知，“中白”Vc含量平均值为49.17 mg/hg，标准偏差（RSD）为0.69%，表明HPLC法精密度良好。

2.3 重复性比对

结果表明，HPLC法重现性良好，RSD为0.68%；国标方法2，6-二氯靛酚滴定法测得的RSD为5.45%（表2）。从表2的数据可知，HPLC法测定的Vc数据稳定，重现性明显优于滴定法。分析原因如下：其一，番木瓜为深颜色果肉，虽通过高岭土褪色，但仍有残留底色，并且通过脱色过滤，延长了Vc溶液的处理时间，容易造成Vc氧化损失；其二，滴定法通过肉眼观察颜色突变终点，势必会存在人为误差。故HPLC法更能客观准确地测定Vc含量。

2.4 回收率分析

将测得的峰面积带入回归方程y=35.41x-4.16（r=0.999），得到各组Vc含量，经计算得到回收率，结果见表3。方法回收率在98.56%～103.21%，平均回收率为100.75%，RSD为0.68%。回收率较稳定，说明采用HPLC法测定番木瓜Vc含量数据可靠。

2.5 提取液的选择

结果表明，这2种提取液对Vc含量的测定没有明显影响（表4），说明草酸和偏磷酸均可作为较好的抑制剂阻止Vc氧化。但由于偏磷酸遇热不稳定，本研究选择2%草酸作为样品浸提剂。液态Vc有较强的还原性，在酸性溶液中较稳定，为保证在整个测试过程中Vc呈现较稳定的状态，故流动相应保持酸性。本研究选用0.2% MPA水溶液及0.1%草酸水溶液作为流动相进行测试，结果均呈单峰且出峰快。出于与浸提剂一致性考虑，本研究选择0.1%草酸作为相关实验的流动相。

2.6 不同品种番木瓜果实中Vc含量比较

通过对海南常见的3个番木瓜品种Vc含量的测定，发现这3种番木瓜品种Vc含量总体差异不大，含量从高到低依次为中白、小青、大青（表5）。

3 讨论与结论

利用全波长扫描Vc标准溶液，发现在254 nm处有最大吸收值，因此选择254 nm作为色谱的检测波长。本研究结果表明，HPLC法线性范围较宽，线性关系良好，说明在测试过程中，Vc受环境干扰少；通过重复性测试可知，HPLC法的RSD为0.68%，说明该方法重现性好，结果稳定、可靠，明显优于传统滴定法，大大减少了肉眼观察滴定终点的误差，提高了测定的准确度。HPLC法的回收率为98.56%～103.21%，说明该方法准确、可靠。综上所述，采用高效液相色谱法测定番木瓜中Vc含量具有选择性好、灵敏度高、操作简单、结果可靠等优点，是测定Vc含量的理想方法。本研究测定了海南常见的3个番木瓜品种果实的Vc含量，发现这3个番木瓜品种Vc含量总体差异不大，从高到低依次为中白、小青、大青。本研究结果可为喜好生食番木瓜的民众提供一定的参考价值。

参考文献

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