补充维生素C对剧烈运动后人体血清炎症因子水平的影响及ROS/NF—κB信号通路在其中的作用

刘绍东++张彦秋

摘 要：目的：探讨补充维生素C对剧烈运动后人体血清炎症因子水平的影响及ROS/NF-κB信号通路在其中的作用。方法：随机选取20名健康男性在校大学生，分为实验组和对照组。运动开始前分别给予两组大学生维生素C片3.0 g和安慰剂口服。两组大学生分别按照75%VO2max进行跑台运动，持续时间为1 h，并于运动干预开始前10 min、结束后0 h和2 h分别采集静脉血，分离血清和血细胞，并利用ELISA法检测外周血IL-1、IL-6、IL-8含量；由血细胞中分离白细胞后，分别测定白细胞中活性氧（ROS）水平和IKKα激酶活性。结果：剧烈运动后，两组大学生外周血白细胞均明显升高，组间无明显差异；对照组外周血IL-1、IL-6、IL-8含量均表现出逐渐升高的趋势，而实验组未表现出此趋势，其中IL-1水平运动前后无明显变化。此外，两组大学生外周血白细胞中IKKα活性均表现出先升后降的变化趋势，其中实验组升高趋势明显低于对照组。而白细胞中ROS水平却表现出逐渐升高的趋势，其中以对照组升高趋势更明显，组间差异有统计学意义。结论：剧烈运动可以引起白细胞中ROS/NF-κB信号通路活化和血清炎症因子水平升高，而运动前补充维生素C可以有效抑制白细胞中ROS/NF-κB信号通路活化介导的血清炎症因子水平升高。

关键词：剧烈运动；ROS/NF-κB信号通路；炎症因子；维生素C

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2015）03-0062-05

Abstract：Objective： To illustrate the effect of Vitamin C on the serum level of inflammatory factors and the role of ROS/NF-κB signaling pathway.Methods：10 healthy male college students were randomly selected and equally divided into experiment group and control group. Vitamin C （3.0 g） and placebo were given prior to treadmill running exercise for 1 h， the strength of which was equal to 75% VO2max. Venous blood was collected at 10 min before the beginning， 0 h and 2 h after the end of the exercise， respectively. The levels of IL-1， IL-6 and IL-8 were detected using ELISA method. The level of reactive oxygen species （ROS） and the activity of IKKα in white blood cells were also measured.Results： After the strenuous exercise， the leukocyte number in peripheral blood was significantly increased in both groups， however， there was no significant differences. The levels

近年来，运动与免疫的关系已成为运动医学领域的研究热点。大量实验证据表明，人体长期坚持进行适量的有氧运动可以明显改善机体免疫机能，而长时间、大强度运动可引起人体免疫机能短期内迅速减退、免疫系统稳态失衡，并可导致机体抗病能力降低[1-3]。动物实验发现，长时间高强度运动可引起大鼠骨髓中有核细胞产生量明显减少以及胸腺萎缩，而胸腺萎缩可进一步诱使T淋巴细胞增殖、分化和成熟障碍[4]。与动物实验结果相似，优秀运动员进行短时间剧烈运动后，机体外周血淋巴细胞总数明显降低，淋巴细胞中DNA氧化损伤明显增加，外周血中IL-6水平急剧升高，且IL-1水平也有明显升高，并持续至运动后24 h[5-8]。由此可见，免疫失衡和炎症介质的异常释放是除激素、神经递质、骨骼肌损伤和Toll样受体表达之外，运动性免疫抑制的重要机制，但IL-1和IL-6等炎症介质异常释放的具体机制仍尚未阐明[9]。

维生素C是一种常见的水溶性维生素，它可以作为电子供体直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），因此，维生素C常被视为细胞外液中主要的抗氧化物质[10]。为了阐明上述问题，本实验拟选取在校大学生进行大强度长时间体育活动，并用维生素C预干预，观察其外周血中ROS/核转录因子κB（nuclear factor - κB，NF-κB）信号通路的活化情况，评估其在剧烈运动和补充维生素C对人体外周血炎症因子释放调节中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验对象和主要试剂

由某高校随机选取20名男性在校大学生参加本次研究，平均年龄为22.7±0.95岁。所有大学生入组时均进行全身体格检查，心肺听诊和体表心电图检查，以进一步评估其心肺功能，尽量避免实验过程可能出现的安全隐患，受试者均身体健康，无器质性病变。

维生素C片购自湖北华中制药有限公司；人外周血白细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物制品有限公司；细胞活性氧检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞IKKα激酶活性定量检测试剂盒购自上海一基生物试剂有限公司；人IL-1、IL-6、IL-8 ELISA检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司；其余常规试剂均为国产分析纯。

1.2 实验分组和运动方案

将20名大学生随机分为实验组和对照组（均为n=10），在运动干预开始前2 w集中进行负荷递增的跑台运动，利用运动心肺测试系统（Jaeger，德国）实时测定以下指标：摄氧量（volume of oxygen uptake，VO2）、CO2呼出量（volume of expiratory CO2，VCO2）、呼吸交换率和心率。测试结束后，根据每个人的最大VO2（VO2max）分别建立VO2与跑台速度的回归方程，计算75%VO2max对应的速度，并作为本次实验的运动负荷。[JP]

为了避免饮食对人外周血炎症因子含量的影响，在运动干预开始前2 w即对所有20名大学生进行合理膳食教育和指导。督促其科学合理安排三餐，保证各类营养素种类齐全、比例适宜、数量充足。除正常进餐外，不额外加餐，不吃零食，不吸烟饮酒，研究人员每日随访记录其就餐情况，以保证实验期间饮食结构的合理性。

1.3 分组干预

运动干预当日早8时，所有20名大学生统一进食早餐，实验组10名大学生随餐送服维生素C片3.0 g，对照组10名大学生给予安慰剂（淀粉片）。进食早餐后30 min开始准备活动，随后以前期计算所得运动负荷进行跑台运动，运动时间为1 h。运动干预开始前10 min、结束后0 h和2 h分别采集静脉血5 mL，其中2 mL注入抗凝管并摇晃数次用于检测血细胞分类计数，剩余3 mL注入普通采血管，静置2 h后以2 500 rpm离心5 r/min，其中上清液用于测定血清中炎症因子含量，下层血细胞用于分离白细胞。

1.4 ELISA

按照人血清ELISA检测试剂盒操作说明，分别检测外周血IL-1、IL-6、IL-8含量，样本量为n=10，各组均设置3个复孔。

1.5 白细胞分离

分组干预结束后，收集所有血液标本，用于集中分离提取白细胞。按照人外周血白细胞分离液试剂盒说明书进行具体操作，裂解红细胞，分离提取白细胞。

1.6 细胞内ROS水平测定

为测定白细胞内ROS水平，将新鲜分离所得白细胞用37℃预热的PBS（含10 μmol/L H2DCFDA，ROS荧光探针）重悬，37℃孵育30 min，随后800 rpm离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次后用500 μL重悬，立即于流式细胞仪测定488 nm激发波长处绿色荧光强度，样本量为n=10。

1.7 白细胞IKKα激酶活性

按照细胞IKKα激酶活性定量检测试剂盒说明书中的操作步骤分别测定各组白细胞IKKα激酶活性。

1.8 统计学分析

所有计量资料均用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义，所有统计分析均在SPSS 17.0上进行。

2 结果

2.1 外周血白细胞计数

如图1所示，剧烈运动后，实验组和对照组人外周血白细胞计数均明显升高（均为P<0.01），且两组间白细胞计数升高幅度无明显差异（P>0.05）。与运动

3 讨论

本研究利用在校男大学生进行1小时高强度运动，于运动前后采集外周血，检测血清中炎症因子表达水平、白细胞计数、白细胞中ROS水平和IKKα活性，以阐述ROS/NF-κB信号通路在剧烈运动诱发炎症因子释放中的作用，同时设立维生素C干预组，评估运动前补充维生素C对上述过程的影响及其中可能的机制。研究结果证实：剧烈运动可能通过诱导外周血白细胞中ROS/NF-κB信号通路的活化进而促进IL-1、IL-6和IL-8等炎症介质的合成和释放，而维生素C可显著降低白细胞中ROS水平，抑制NF-κB的活化，从而发挥减轻剧烈运动诱导炎症介质释放的保护作用。

长时间剧烈运动时，机体处于应激状态，糖皮质激素和肾上腺素等应激激素将随之升高，上述激素（尤其是糖皮质激素）可促进储存池中白细胞释放进入循环池[13]。本研究发现，在校大学生以相当于75%VO2max的高强度运动1 h可引起外周血中白细胞计数明显升高，而且这一作用至少持续2 h以上，同时，血清中IL-1、IL-6、IL-8三种主要炎症因子的含量也表现出明显的升高趋势。其中，单核-巨噬细胞含量升高可能是IL-1和IL-6水平升高的主要原因，而IL-6水平的过度升高则可诱发机体抵抗细菌感染的能力明显降低[14]。本实验发现在剧烈运动诱发机体高表达炎症因子的同时，白细胞中ROS和IKKα活性均表现出明显升高的趋势，而ROS/NF-κB信号通路已被证实参与多种细胞表达炎症因子的过程[15-16]，因此，通过本研究结果可以初步得出ROS/NF-κB信号通路参与剧烈运动诱导机体外周血炎症因子水平升高的结论。

维生素C是一种常见的抗氧化物质，具有容易获取、价格低和抗氧化作用明显等特点。本研究发现运动前给予维生素C口服可以有效抑制剧烈运动上调白细胞中ROS水平的幅度明显下降，即有效抑制剧烈运动引起的氧化爆发。IKKα是NF-κB活化的重要标志，本研究还发现，在口服维生素C抑制白细胞氧化爆发的同时，白细胞中IKKα活化程度也明显较对照组明显降低，这说明维生素C可能通过抑制ROS产生而下调IKKα活性，从而抑制IκB磷酸化程度，减少NF-κB向细胞核移位，抑制炎症因子相关基因的表达活性。

综上所述，剧烈运动前补充维生素C可能通过抑制白细胞中ROS/NF-κB信号通路的活化下调炎症因子表达，继而减轻剧烈运动诱发的免疫功能紊乱，而进一步研究将有助于明确维生素C在预防剧烈运动诱发免疫功能紊乱中作用，为降低运动员比赛和训练后上呼吸道感染等事件发生率提供有效的防治策略。

参考文献：[HT5"SS]

[1]Tofighee A， Khazaei HA， Jalili A. Comparison of Effect of One Course of Intense Exercise （Wingate test） on Serum Levels of Interleukin-17 in Different Groups of Athletes [J]. Asian J Sports Med， 2014 ， 5（4）：e22769.

[2]Cruzat VF， Krause M， Newsholme P. Amino acid supplementation and impact on immune function in the context of exercise [J]. J Int Soc Sports Nutr， 2014， 11（1）：61.

[3]Jahromi AS， Zar A， Ahmadi F，et al.Effects of Endurance Training on the Serum Levels of Tumour Necrosis Factor-α and Interferon-γ in Sedentary Men [J]. Immune Netw， 2014， 14（5）：255-259.

[4]Kakanis MW， Peake J， Brenu EW，et al. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male elite atllletes [J]. Exerc Immunol Rev， 2010， 16： 119-137.

[5]Akil M， Gurbuz U， Bicer M，et al.Selenium prevents lipid peroxidation in liver and lung tissues of rats in acute swimming exercise [J]. Bratisl Lek Listy， 2015， 116（4）：233-235.

[6]Tanimura Y， Shimizu K，Tanabe K. Effects of three consecutive days exercise on lymphocyte DNA damage in young men [J]. Eur J Appl Physiol， 2010， 110（2）： 307-314.

[7]Ives SJ， Blegen M， Coughlin MA，et al.Salivary estradiol， intereukin-6 production，and the relationship to substrate metabolism[LL][HJ2mm]

during exercise in females [J]. Eur J Appl Physiol， 2011， 111（8）： 1649-1658.

[8]Kim JS， Lee YH， Kim JC，et al.Effect of exercise training of different intensities on anti-inflammatory reaction in streptozotocin-induced diabeticrats [J]. Biol Sport， 2014 ， 31（1）：73-79.

[9]Krüger K， Agnischock S， Lechterman N，et al.Intensive resistance exercise induces lymphocyte apoptosis via cortisol and glucocorticoid receptor-dependent pathways [J]. J Appl Physiol， 2011， 110（5）： 1226-1232.

[10]王雪芹， 郝选明. 运动与免疫研究进展 [J]. 中国运动医学杂志， 2012， 31（12）： 1127-1133.

[11]陈伟， 林映才， 马现永， 等. 一些抗氧化剂的抗/促氧化作用及其机制 [J]. 动物营养学报， 2012， 24（4）： 595-605.

[12]Zhang H， Wang ZW， Wu HB，et al.Transforming growth factor-beta 1 induces matrix metalloproteinase-9 expression in rat vascular smooth muscle cells via ROS-dependent ERK-NF-kappa B pathways [J]. Mol Cell Biochem， 2013， 375（1-2）： 11-21.

[13]Yang CT， Ling HZ， Zhang MF，et al.Oxidative stress mediates chemical hypoxia-induced injury and inflammation by activating NF-kappa b-COX-2 pathway in HaCaT cells [J]. Mol Cells， 2011， 31（6）： 531-538.

[14][JP3]Lau KK， Obeid J， Breithaupt P，et al.Effects of acute exercise on markers of inflammation in pediatric chronic kidney disease： a pilot study [J]. Pediatr Nephrol， 2015 ， 30（4）：615-621. [JP]

[15]Aoi W， Naito Y， Yoshikawa T. Role of oxidative stress in impaired insulin signaling associated with exercise-induced muscle damage [J]. Free Radic Biol Med， 2013， 65：1265-1272.

[16]El Assar M， Angulo J， Rodríguez L. Oxidative stress and vascular inflammation in aging [J]. Free Radic Biol Med， 2013， 65：380-401