橡胶树HbGAIP—B基因的克隆与表达分析

吴绍华 郝泽芸 张世鑫 邓小敏 田维敏

摘 要 DELLA是赤霉素信号传导途径中一类重要的阻遏蛋白。本研究通过RT-PCR技术，从橡胶树优良品种‘热研7-33-97胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因（GenBank登录号为KT696440）。该基因全长cDNA序列2 135 bp，阅读框1 905 bp，编码634个氨基酸，其编码蛋白含有DELLA和GRAS结构域，分子量为69.89 ku，理论等电点为5.50。HbGAIP-B氨基酸序列与麻疯树JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、拟南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分别为82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。进化树分析表明，HbGAIP-B与JcGAIP-B亲缘关系最近。定量PCR分析表明，HbGAIP-B的表达受割胶处理诱导下调。赤霉素和乙烯利处理4 h显著上调HbGAIP-B的表达，茉莉酸甲酯处理4 h小幅下调HbGAIP-B表达。

关键词 巴西橡胶树；HbGAIP-B；基因克隆；基因表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract DELLA are kind of repressor proteins of GA signaling. In this work，a full length cDNA sequence of HbGAIP-B（GenBank accession no. KT696440）was obtained from the latex of rubber tree clone‘CATAS7-33-97by RT-PCR. HbGAIP-B was 2 135 base pairs（bp）in length and contained an open reading frame（ORF）of 1 642 bp. The ORF encoded 613 amino acid residues， which contained DELLA and GRAS domain， with a predicted molecular mass of 66.476 ku and a pI of 5.19. The deduced amino acid sequences of HbGAIP-B showed high identities of 82.43%， 78.18%， 65.05%， 61.73%， 52.28%， 53.51% and 49.92% to JcGAIP-B， RcGAIP-B， AtRGA， AtGAI， AtRGL1， AtRGL2 and AtRGL3， respectively. Real-time quantitative PCR analysis in the latex showed that， compared with the control， HbGAIP-B transcript levels were significantly down-regulated in latex by consecutive tapping. The transcript levels were significantly up-regulated at 4 hours by gibberellins and ethephon. And methyl jasmonate reduced slightly the expression of HbGAIP-B.

Key words Hevea brasiliensis； HbGAIP-B； Gene clone； Gene expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.006

赤霉素（Gibberellins 或 Gibberellic acid，GA）是一种四环双萜类植物激素，在植物生长发育、逆境胁迫中起着重要的调控作用。GID1（GIBBERELLIN

INSENSITIVE DWARF 1）和DELLA蛋白是GA信号转导途径的两个重要组分。其中GIDl是GA的受体[1-2]，DELLA蛋白是GA 信号通路中关键的负调节因子[3-5]。GA通过与GID1、DELLA蛋白相互作用形成GA-GID1-DELLA复合体，使得DELLA蛋白被26S泛素蛋白酶体降解[6-8]，解除了DELLA蛋白的阻遏作用，从而启动了下游基因的表达。DELLA蛋白属于转录因子GRAS（GAI，RGA，SCR）家族，在C端有保守的GRAS结构域，在N端有特异的DELLA结构域。目前，在拟南芥中鉴定了5个DELLA蛋白：GA INSENSITIVE（GAI）：REPRESSOR OF ga1-3 （RGA）：REPRESSOR OF ga7-i-LIKE protein（RGL）l，RGL2和RGL3，遗传分析表明，这5个蛋白在调节植物发育中的功能既有冗余性也有各自独特的作用[3-4，9-11]。而且，DELLA蛋白在赤霉素、茉莉酸和乙烯三种植物激素介导的信号途径的交互作用中起着重要的作用[12]。

橡胶树（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是一种多年生木本热带经济作物，通过割胶方式获得的胶乳是提炼天然橡胶的原料，在保障国民和战略需求中起着重要的作用。现有的证据表明，胶乳中的橡胶烃是一种重要的防御应答诱导的次生代谢产物[13]，可能主要受乙烯和茉莉酸信号途径的调控[13-21]。由于DELLA蛋白在乙烯和茉莉酸信号途径中的重要调控作用。为了进一步研究胶乳中DELLA蛋白的作用机制，本研究从乳管细胞中克隆了一个DELLA蛋白基因HbGAIP-B的全长cDNA，并分析了其在割胶、赤霉素、乙烯利（Ethephon，ET）和茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）处理下的基因表达模式，为深入研究HbGAIP-B基因在胶乳中的作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料橡胶树‘热研7-33-97（CATAS 7-33-97）由“国家农作物种质资源平台-国家橡胶树种质资源子平台”提供。割胶处理时，按照1/2螺旋割线，3 d/刀（S/2 d/3）的割制对树围一致的8年生未开割树进行连续割胶处理，分别采集前3刀的胶乳于RNA提取液中，每处理5棵树。植物激素赤霉素（gibberellic acid，GA）、乙烯利（Ethephon，ET）及茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）的处理采用的是1年生的萌条，轻轻刮伤萌条第三伸长单位的节间树皮，然后分别用100 μmol/L GA3、0.5% ET和0.07% MeJA涂抹刮伤部位后包裹，100 μmol/L GA3和0.5% ET的对照为灭菌水（ddH2O），0.07% MeJA处理的对照为6%的乙醇，分别于处理后的4 h、8 h、1 d、2 d和3 d用刀片割开树皮取胶乳，每个时间点处理9根萌条，将混合的胶乳采集于RNA提取液中用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA合成 采用RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）提取橡胶树的胶乳RNA，DNaseⅠ柱上消化RNA样品中残留的微量DNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher）逆转录合成cDNA。

1.2.2 HbGAIP-B基因的全长cDNA扩增 从巴西橡胶树胶乳转录组数据库中获得了一段注释为DELLA蛋白的Unigene序列，序列分析显示该Unigene具有完整的编码框。因此，根据Unigene序列设计该基因的全长cDNA的扩增引物FL-CDNA-F（5′-CCTTACCCATTCGCAGCAG-3′）和FL-CDNA-R（5′-ACCCATTACCAGCTCAGC-3′）对基因序列进行验证，扩增体系为Takara PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，FL-CDNA-F（10 μmol/L）2.5 μL，FL-CDNA-R（10 μmol/L）2.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水补足50 μL。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。0.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）纯化目的条带，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（TransGen），委托Invitrogen公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 采用ORF Finder软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）进行开放阅读框（ORF）预测，同时翻译成蛋白序列。DNAMAN软件对氨基酸进行同源比对分析。ProtParam软件（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html/）在线分析该蛋白的分子量与等电点。ProtScale软件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白亲水性。TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白的跨膜结构域分析。SOPMA在线软件（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）预测蛋白的二级结构。从NCBI数据库下载不同植物的DELLA蛋白序列，利用软件MEGA 4.0采用Neighbor-Joining（NJ）模型，并进行1 000次Bootstrap统计学检验构建包括HbGAIP-B蛋白序列在内的植物DELLA蛋白系统进化树。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 以橡胶树HbActin（GenBank HQ260674.1）基因为内参，用real-time RT-PCR分析割胶、GA、ET和MeJA处理对HbGAIP-B基因表达的影响。内参基因引物为Actin-F（5′-G

ATTCCGTTGCCCAGAAGTC-3′）和Actin-R（5′-CACC

ACTCAGCACAATGTTACC-3′）；HbGAIP-B定量引物为GAIP-B-F（5′-ACTCGTTCTCAACTCAGGCA-3′）和GAIP-B-R（5′-ACCAGCTCAGCAATTCACAT-3′）。

反应体系：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）5 μL和10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，ddH2O补足10 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；循环完成后进行溶解曲线分析。利用CFX manager 3.0软件，以HbActin作为内参基因，采用2-ΔΔCq算法分析基因的相对表达量。

1.3 数据处理

采用one-way ANOVA（Newman-Keuls Multiple Comparison Test）比较割胶处理3个刀次样品间基因表达量的差异显著性（p<0.05）；采用one-way ANOVA（Dunnett's Multiple Comparison Test）比较GA、ET和MeJA处理与对照样品间相对表达量的差异显著性，p<0.05和p<0.01分别表示每个时间点处理与对照之间在0.05和0.01水平存在的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 HbGAIP-B基因全长cDNA的克隆及生物信息学分析

通过全长cDNA序列的扩增测序，获得HbGAIP-B基因全长cDNA序列2 135 bp，含有1 905 bp阅读框，编码634个氨基酸，5′非编码区序列（Untranslated region，UTR）长118 bp，3′-UTR长112 bp（图1）。生物信息学分析结果显示，HbGAIP-B蛋白的分子式为C3 073H4 793N857O957S26，分子量为69.89 ku，理论等电点为5.50，不稳定系数为48.08，为不稳定类蛋白，无跨膜结构域，属于亲水性蛋白。结构域分析显示HbGAIP-B蛋白具有GRAS家族的典型结构域，属于GRAS转录因子家族，N末端同源性不高，但具有GA的信号感知区的DELLA和TVHYNP酸性结构域，中心区具有VHVID、核定位区域NLS，起调节作用的LZ（亮氨酸重复序列）和PolyS/T/V（丝氨酸 苏氨酸 缬氨酸富集区）区域，C末端具有发挥阻遏作用的阻遏区域RVER和SAW（图2）。二级结构分析显示HbGAIP-B蛋白由44.79% α-螺旋、15.30%延伸链、7.26% β-转角和32.65%无规则卷曲组成。

2.2 HbGAIP-B推导的氨基酸序列比对及进化树构建

将橡胶树HbGAIP-B氨基酸序列与其它植物DELLA蛋白氨基酸序列进行比对，发现HbGAIP-B与与麻疯树（Jatropha curcas）JcGAIP-B（XP_

012072251.1）、蓖麻（Ricinus communis）RcGAIP-B （XP_002527794.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana） AtRGA（NP_178266.1）、AtGAI（NP_172945.1）、AtRGL1（NP_176809.1）、AtRGL2（AEE73945.1）和AtRGL3（AED92433.1）的相似性分别为82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%（图2）。构建的进化树表明，橡胶树HbGAIP-B氨基酸序列与麻疯树JcGAIP-B归为一类，亲缘关系最近（图3）。

2.3 HbGAIP-B基因表达分析

采用qRT-PCR技术，以HbActin基因为内参，检测了连续割胶（Tapping）、赤霉素（GA）、乙烯利（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）对胶乳中的HbGAIP-B基因表达的影响（图4）。结果表明，HbGAIP-B基因的表达受割胶处理诱导下调，前3刀间的基因表达达显著水平（图4-A）。同时，HbGAIP-B基因的表达也受植物激素的调节，表现为GA处理4 h极显著上调HbGAIP-B基因表达（图4-B）；ET处理4 h后显著上调HbGAIP-B基因的表达量，8 h表达量达到最高（图4-C）；MeJA处理4 h后显著下调HbGAIP-B基因的表达，2 d后极显著上调HbGAIP-B基因的表达（图4-D）。

3 讨论

橡胶树乳管数量、两次割胶间的胶乳再生与排胶时间是决定橡胶产量的关键因素。乙烯利是广泛使用的橡胶增产刺激剂，其效应主要是通过提高橡胶树乳管细胞的基础代谢和延长胶乳的排胶时间来实现的[22-24]。在乙烯信号响应中，ET通过促进ETHYLENE INSENSITIVE3（EIN3）和EIN3-like（EIL）的积累来促进其下游的级联反应。DELLA蛋白能与EIN3结合抑制其功能。施加GA处理，可以引起DELLA蛋白的降解，释放出EIN3促进乙烯信号的响应[12]。据此推测，施加ET和GA可能具有相似的效应，这与本研究中GA处理和ET处理样品中HbGAIP-B基因的表达均为先升高后降低的模式是吻合的。而且ET处理HbGAIP-B基因表达模式与RhGAI1相似，在玫瑰花研究中发现，RhEIN3-3能直接结合RhGAI1基因启动子进而调控花瓣发育[25]。另外，DELLA蛋白RGL3可通过竞争性结合JAZ蛋白来增强EIN3的活性[26]。

茉莉酸是调控橡胶生物合成的关键因子，目前已发表的橡胶树茉莉酸信号途径的核心组件包括SCF[27]、COI1[28]、JAZs[15，29]、MYCs[17，30]，这些基因的表达受到伤害、割胶或者MeJA的诱导。研究发现，拟南芥DELLAs可竞争性的阻止阻遏蛋白JAZ与转录激活因子MYC2的结合，从而提高MYC2调控其靶基因的能力[31]。Wild等[32]证实MYC2能直接与RGL3启动子结合，而RGL3也能与JAZ蛋白互作，表明RGL3蛋白对于JA介导的响应是必不可少的。而且拟南芥DELLA蛋白RGA通过结合MYC2抑制次生代谢产物倍半萜烯合成酶基因TPS21和TPS11的表达[33]。本研究中HbGAIP-B基因表达受割胶处理诱导下调，且HbGAIP-B基因的表达也受植物激素的调节。结合割胶、ET、MeJA处理对HbGAIP-B基因表达的影响，推测HbGAIP-B可能通过茉莉酸或乙烯信号途径参与橡胶树的胶乳代谢，具体作用机制还有待于深入的研究。

参考文献

[1] Ueguchi-Tanaka M， Ashikari M， Nakajima M， et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin[J]. Nature， 2005， 437（7059）： 693-698.

[2] Nakajima M， Shimada A， Takashi Y， et al. Identification and characterization of Arabidopsis gibberellin receptors[J]. The Plant Journal： for cell and molecular biology， 2006， 46（5）： 880-889.

[3] Lee S， Cheng H， King K E， et al. Gibberellin regulates Arabidopsis seed germination via RGL2， a GAI/RGA-like gene whose expression is up-regulated following imbibition[J]. Genes & Development， 2002， 16（5）： 646-658.

[4] Peng J， Carol P， Richards D E， et al. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses[J]. Genes & Development， 1997， 11（23）： 3 194-3 205.

[5] Dill A， Sun T. Synergistic derepression of gibberellin signaling by removing RGA and GAI function in Arabidopsis thaliana[J]. Genetics， 2001， 159（2）： 777-785.

[6] Fu X， Richards D E， Ait-Ali T， et al. Gibberellin-mediated proteasome-dependent degradation of the barley DELLA protein SLN1 repressor[J]. The Plant Cell， 2002， 14（12）： 3 191-3 200.

[7] Sasaki A， Itoh H， Gomi K， et al. Accumulation of phosphorylated repressor for gibberellin signaling in an F-box mutant[J]. Science， 2003， 299（5614）： 1 896-1 898.

[8] McGinnis K M， Thomas S G， Soule J D， et al. The Arabidopsis SLEEPY1 gene encodes a putative F-box subunit of an SCF E3 ubiquitin ligase[J]. The Plant Cell， 2003， 15（5）： 1 120-1 130.

[9] Harberd N P， Belfield E， Yasumura Y. The angiosperm gibberellin-GID1-DELLA growth regulatory mechanism： how an “inhibitor of an inhibitor” enables flexible response to fluctuating environments[J]. The Plant Cell， 2009， 21（5）： 1 328-1 339.

[10] Silverstone A L， Ciampaglio C N， Sun T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway[J]. The Plant Cell， 1998， 10（2）： 155-169.

[11] Wen C K， Chang C. Arabidopsis RGL1 encodes a negative regulator of gibberellin responses[J]. The Plant Cell， 2002， 14（1）： 87-100.

[12] Davière J M， Achard P. A pivotal role of DELLAs in regulating multiple hormone signals[J]. Molecular Plant， 2016， 9（1）： 10-20.

[13] Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 37-43.

[14] Zeng R， Duan C， Li X， et al. Vacuolar-type inorganic pyrophosphatase located on the rubber particle in the latex is an essential enzyme in regulation of the rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Science， 2009， 176： 602-607.

[15] Tian W M， Huang W F， Zhao Y. Cloning and characterization of HbJAZ1 from the laticifer cells in rubber tree（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）[J]. Trees 2010， 24： 771-779.

[16] Wu J L， Hao B Z， Tan H Y. Wound-induced differentiation in Hevea brasiliensis shoots mediated by jasmonic acid[J]. Journal of Rubber Research， 2002， 5： 53-63.

[17] Zhao Y， Zhou L M， Chen Y Y， et al. MYC genes with differential responses to tapping， mechanical wounding， ethrel and methyl jasmonate in laticifers of rubber tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（14）： 1 649-1 658.

[18] 赵 悦. 巴西橡胶树乳管细胞茉莉酸信号途径对橡胶生物合成调节的研究[D]. 海口： 海南大学， 2011.

[19] Hao B Z， Wu J L. Biology of laticifers in Hevea and latex production[J]. Chinese Journal of Tropical Crops（热带作物学报）， 2004， 25（4）： 1-7.

[20] Tang C R， Huang D B， Yang J H， et al. The sucrose transporter HbSUT3 plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. Plant， Cell & Environ， 2010， 33（10）： 1 708-1 720.

[21] Tungngoen K， Kongsawadworakul P， Viboonjun U， et al. Involvement of HbPIP2；1 and HbTIP1；1 aquaporins in ethylene stimulation of latex yield through regulation of water exchanges between inner liber and latex cells in Hevea brasiliensis[J]. Plant Physiology， 2009， 151（2）： 843-856.

[22] D'Auzac J， Jacob J L， Prevot J C， et al. The regulation of cis-polyisoprene production（natural rubber）from Hevea brasiliensis[J]. Present Research development in Plant Physiology， 1997， 1： 273-331.

[23] Zhu J H， Zhang Z L. Ethylene stimulation of latex production in Hevea brasiliensis[J]. Plant Signalling & Behavior， 2009， 4（11）： 1 072-1 074.

[24] 庄海燕， 安 锋， 张硕新， 等. 乙烯利刺激橡胶树增产机制研究进展[J]. 林业科学： 2010， 46（4）： 120-125.

[25] Luo J， Ma N， Pei H， et al. A DELLA gene， RhGAI1， is a direct target of EIN3 and mediates ethylene-regulated rose petal cell expansion via repressing the expression of RhCesA2[J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（16）： 5 075-5 084.

[26] Wild M， Achard P. The DELLA protein RGL3 positively contributes to jasmonate/ethylene defense responses[J]. Plant Signaling & Behavior， 2013， 8（4）： e23 891.

[27] Ma R F， Wang L F， Peng S Q， et al. cDNA cloning and expression analysis of three components of SCFCOI1 complex in Hevea brasiliensis[J]. Journal of Rubber Research， 2012， 15： 141-152

[28] Peng S Q， Xu J， Li H L， et al. Cloning and molecular characterization of HbCOI1 from Hevea brasiliensis[J]. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2009， 73， （3）： 665-670.

[29] Hong H， Xiao H， Yuan H， et al. Cloning and characterisation of JAZ gene family in Hevea brasiliensis[J]. Plant Biol（Stuttg）， 2015， 17（3）： 618-624.

[30] Pirrello J， Leclercq J， Dessailly F， et al. Transcriptional and post-transcriptional regulation of the jasmonate signalling pathway in response to abiotic and harvesting stress in Hevea brasiliensis[J]. BMC plant biology， 2014， 14： 341.

[31] Hou X， Lee L Y， Xia K， et al. DELLAs modulate jasmonate signaling via competitive binding to JAZs[J]. Developmental Cell， 2010， 19（6）： 884-894.

[32] Wild M， Daviere J M， Cheminant S， et al. The Arabidopsis DELLA RGA-LIKE3 is a direct target of MYC2 and modulates jasmonate signaling responses[J]. The Plant Cell 2012， 24（8）： 3 307-3 319.

[33] Hong G J， Xue X Y， Mao Y B， et al. Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthase gene expression[J]. The Plant Cell， 2012， 24（6）： 2 635-2 648.