中药癌复康对重症联合免疫缺陷鼠人乳腺癌肺转移及免疫重建的影响

朱华宇，钟少文，李玉洁，吴元胜

(广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120)



论著

中药癌复康对重症联合免疫缺陷鼠人乳腺癌肺转移及免疫重建的影响

朱华宇，钟少文，李玉洁，吴元胜

(广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120)

[摘要]目的探讨中药癌复康对重症联合免疫缺陷(SCID)鼠原位移植人乳腺癌自发性肺转移及免疫重建的影响。方法将40只SCID小鼠随机分为4组，以高转移人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435s)接种于鼠腹部左侧第二乳头下的乳房脂肪垫上建立小鼠人乳腺癌自发性肺转移模型，接种量为0.2 mL/只。接种后，模型对照组给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌复康组给予癌复康3.6g/(kg·d)以生理盐水10 mL稀释灌胃，1次/d；免疫重建组腹腔注射人体外周血淋巴细胞4×107个/只(0.5 mL)，并给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌复康+免疫重建组腹腔注射人体外周血淋巴细胞4×107个/只，并予以癌复康3.6 g/(kg·d)以生理盐水10 mL稀释灌胃，1次/d。观察各组肿瘤体积、生长速度、肿瘤转移情况。结果 癌复康+免疫重建组成瘤潜伏期明显长于其余3组(P均<0.05), 癌复康组和免疫重建组成瘤潜伏期明显长于模型对照组(P<0.05)；模型对照组肿瘤生长速度较其余3组快，肿瘤体积大于其余3组(P均<0.05)，癌复康组和免疫重建组肿瘤生长速度相近(P>0.05),癌复康+免疫重建组肿瘤生长速度最慢(P均<0.05)；癌复康组、免疫重建组、癌复康+免疫重建组乳腺癌肺转移抑制率分别为64.7%，38.4%和84.8%，3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论中药癌复康能延长人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s接种SCID鼠成瘤潜伏时间，促进SCID鼠的免疫重建，具有一定的抑制肿瘤生长和抗肿瘤转移的作用。

[关键词]乳腺癌；癌复康；人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s；重症联合免疫缺陷；小鼠；免疫重建

中医药扶正祛邪法治疗乳腺癌在机制上与免疫生物治疗相似，主要是提高肿瘤患者的免疫功能。中药复方癌复康为全国名老中医林毅教授治疗乳腺癌经验方，具有显著抗肿瘤复发转移作用[1]。本研究采用严重联合免疫缺陷基因(Severe combined imunodeficiency，SCID)小鼠和高转移人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435s)建立小鼠人乳腺癌自发性肺转移模型，旨在观察癌复康对原位移植人乳腺癌SCID鼠肺转移及免疫重建模型的干预作用。

1实验资料

1.1实验动物选取4～6周龄无免疫渗漏(血IgG<5 μg/mL)的雌性SCID小鼠40只，体质量15～22 g，由中国科学院北京动物实验中心提供，合格证号：SCXK(京)2005-0013。饲养在广东省医学动物实验中心无特定病原体(specific pathogen free,SPF)环境中，许可证号：SYXK(粤)2003-0002。动物实验前适应性喂养1周，标准颗粒饲料、饮水、灌胃用药及垫料均经高压灭菌处理(126 ℃，20 min)。饲养条件：室温(25±2)℃，湿度45%～50%，在SPF实验室独立自动送风分笼隔离系统(IVC)内饲养。

1.2药物癌复康方由黄芪、茯苓、炒白术、太子参、淮山药、肉苁蓉、山萸肉、女贞子、南沙参、制首乌、枸杞、莪术、半枝莲、薏苡仁组成。本实验药材均购自广东省中医院中药房，由广东省中医院制剂室鉴定均符合《中华人民共和国药典》2005年版质量要求，并按传统工艺煎煮、过滤、醇沉，回收溶剂至浸膏状，使每毫升含生药3.2 g，4 ℃冰箱保存备用。

1.3肿瘤细胞系人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s由中国科学院上海细胞研究所提供，用含10%胎牛血清(FBS)、0.01 mg/mL 谷氨酰胺、0.01 mg/mL胰岛素的L15培养基在5%CO2，37 ℃条件下培养，传代1～2次/周。

1.4主要试剂及仪器Lympholyte-H 人淋巴细胞分离液、Leibovitz L15培养基(上海博升生物科技有限公司)；IgG ELISA检测试剂盒(华美公司)；电子数显卡尺(广州广卓精密仪器有限公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；电子天平(德国sartorius公司)。

1.5方法

1.5.1人体外周血淋巴细胞(PBL)的分离抽取健康人外周血，用人淋巴细胞分离液(比重为1.077)按常规方法分离(密度梯度离心法分离)。生理盐水洗涤2遍(1 500 r/min×10 min) 后用37 ℃ RPMI-1640培养液吹打重悬离心沉淀细胞，制成均匀细胞悬液；倒置显微镜下观察细胞形态并进行测量，细胞计数，调整细胞浓度为8×107mL-1备用。

1.5.2动物造模参照文献[2-3]方法，取体外培养的对数生长期MDA-MB-435s人乳腺癌细胞，细胞浓度调整为2×107mL-1。无菌条件下，将MDA-MB-435s人乳腺癌细胞接种于SCID小鼠腹部左侧第二乳头下的乳房脂肪垫上，接种量为0.2 mL/只。所有操作均在超净工作台内进行。

1.5.3动物分组与给药方法40只SCID小鼠随机分为4组，每组10只。模型对照组：接种后给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌复康组：按《抗癌药物研究与实验技术》人和动物间按体表面积折算表计算出小鼠的癌复康用量为3.6 g/(kg·d)，接种后用生理盐水10 mL将之稀释灌胃，1次/d；免疫重建组：接种后腹腔注射PBL 4×107个/只(0.5 mL)，并给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌复康+免疫重建组：接种后腹腔注射PBL 4×107个/只(0.5 mL)，并予以癌复康3.6 g/(kg·d)用生理盐水10 mL稀释灌胃，1次/d。各组均干预12周。

1.6观察项目每天观察小鼠的精神状态、活动力、 反应、饮食、毛色、毛顺滑度及瘤组织的生长情况，注意是否出现皮疹、腹泻、步态改变等表现，参照文献[2]标准确定小鼠是否发生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)；每周2次观察并记录每只小鼠体质量、瘤生长潜伏期，统计每组肿瘤移植成功率(每组成瘤只数/ 每组总只数×100%)。 各组小鼠饲养12周后脱颈处死，称体质量；免疫重建组取血用ELISA法测定血中IgG含量；各组解剖取肿瘤瘤块和肺组织，分别用电子天平称质量，计算抑瘤率 [(对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%]；肉眼计数肺表面的灰白色结节，即转移灶,计算肺转移抑制率[(对照组平均肺转移结节数-用药组平均肺转移结节数)/对照组平均肺转移结节数×100%]。电子数显卡尺测量肿瘤最长径(a)及垂直径(b)，按公式V=πab2/6计算肿瘤相对体积。将肿瘤瘤块放入10%中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，超薄切片，苏木素-伊红染色(HE染色)，显微镜观察瘤细胞生长情况。

1.7统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件处理数据。率的比较用卡方检验，均数比较用t检验或单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1SCID小鼠成瘤情况4组SCID小鼠全部存活，均未发生GVHD；接种人乳腺癌细胞MDA-MB-435s后在接种部位乳垫处出现肿瘤结节，质地较硬；成瘤率为100%，显微镜下肺转移率为100%。免疫重建组12周时小鼠血中IgG达(128.48±4.76)mg/L。模型对照组成瘤潜伏期为(6.5±1.3)d，癌复康组为(14.7±2.5)d，免疫重建组为(13.8±2.7)d，癌复康+免疫重建组为(21.8±3.6)d。癌复康+免疫重建组成瘤潜伏期明显长于其余3组(P均<0.05)，癌复康组和免疫重建组成瘤潜伏期均长于模型对照组(P均<0.05),癌复康组与免疫重建组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2肿瘤体积变化情况4组SCID小鼠在接种部位乳垫处出现肿瘤结节渐增大。模型对照组肿瘤直径为(24.3±0.5)mm，肿瘤生长速度较其余3组快，肿瘤体积显著大于其余3组(P均<0.05)；癌复康组和免疫重建组肿瘤直径分别为(17.8±0.6)mm和(18.3±0.4)mm，肿瘤生长速度差异无统计学意义(P>0.05)；癌复康+免疫重建组肿瘤直径为(12.7±0.2)mm，肿瘤生长速度显著慢于其余3组。见图1。

图1　各组SCID鼠肿瘤体积变化曲线

2.3抑瘤率癌复康组、免疫重建组、癌复康+免疫重建组瘤质量均明显低于模型对照组(P均<0.05)，癌复康+免疫重建组瘤质量明显低于癌复康组和免疫重建组(P均<0.05)，抑瘤率明显高于癌复康组和免疫重建组(P均<0.05)，癌复康组和免疫重建组瘤质量及抑瘤率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组抑瘤率比较

注：①与模型对照组比较，P<0.05；②与癌复康+免疫重建组比较，P<0.05。

2.4肿瘤转移情况癌复康组、免疫重建组、癌复康+免疫重建组肺转移灶数量均明显少于模型对照组(P均<0.05)；癌复康+免疫重建组肺转移灶数量明显少于癌复康组和免疫重建组(P均<0.05)，肺转移抑制率明显高于癌复康组和免疫重建组(P均<0.05)；癌复康组肺转移灶数量明显少于免疫重建组(P均<0.05)，转移抑制率明显高于免疫重建组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组肿瘤转移情况比较

注：①与模型对照组比较，P<0.05；②与癌复康+免疫重建组比较，P<0.05；③与免疫重建组比较，P<0.05。

3讨论

大多数乳腺癌患者致死的主要原因是肿瘤转移而非原发病变，免疫功能低下是恶性肿瘤复发、转移的关键环节。中医学认为肿瘤的发生发展是内因和外因综合作用的结果，在强调外因(邪毒蕴聚于经络、脏腑)的同时，更强调内因(正气虚弱、脏腑功能失调等)在肿瘤发生发展中的作用。中医治疗乳腺癌着眼于标本结合，整体性调节机体阴阳、气血、脏腑、经络功能，调动机体内在防御功能，阻遏肿瘤复发和转移。目前中医药抗肿瘤浸润转移机制研究及探索阻断肿瘤浸润转移的治疗方法、中医药治疗与乳腺癌肿瘤免疫之间的关系逐渐成为近年来乳腺肿瘤研究领域的重要课题。

全国名老中医林毅教授认为乳腺癌的发生是在正气亏虚、脏腑功能紊乱的基础上，外邪与内生的痰湿与血瘀等病理产物相搏而成，乳腺癌患者多因脾肾不足，导致正气内虚，免疫功能低下。正气亏虚、正不抑邪是肿瘤的复发与转移的主要因素，而扶正尤重脾肾。癌复康是其经多年临床实践总结而成的中药方剂，方中黄芪、茯苓、炒白术、太子参、淮山药益气健脾，使气血生化有源；肉苁蓉、山萸肉、女贞子等补肾生髓，调摄冲任；南沙参、制首乌、枸杞养阴补血生津；莪术、半枝莲、薏苡仁活血化瘀，清热解毒，利湿消肿。全方具益气健脾、补肾生髓、抗癌解毒之功。经15年临床应用，在临床取得了延长患者生存期、提高生命质量、稳定瘤灶、防止癌瘤转移的确切疗效。

免疫缺陷动物的出现促进了肿瘤模型、肿瘤免疫和肿瘤治疗等相关研究，SCID小鼠作为肿瘤抗原免疫应答的研究模型，也是研究淋巴细胞分化作用和调控作用的主要模型，其缺乏体液免疫和细胞免疫功能，可以不受干扰地进行免疫诱导、免疫调节、免疫治疗等研究[3-5]。SCID小鼠人类肿瘤移植存活率高达36.9%，一般裸鼠为16.8%，其对恶性肿瘤的移植不但转移率高，而且能广泛扩散，其浸润和转移与人类肿瘤自发性转移相似[6]。由于小鼠乳腺微环境与人相似，植入到SCID小鼠体内的肿瘤组织可出现类似人体内的浸润和转移过程。MDA-MB-435s乳腺癌细胞是一高转移细胞系，能稳定地发生肉眼可见的肺转移，不同于其他细胞株主要是肺部弥漫性浸润，便于实验量化观测[7]。本研究4组SCID小鼠全部存活，均未发生GVHD，成瘤率为100%，显微镜下肺转移率为100%，表明该细胞系可建立良好的乳腺癌原位移植自发性肺转移模型。

SCID小鼠体内植入人外周血淋巴细胞是一种新型的模拟人免疫系统的实验模型，也是迄今为止较具说服力的用于评估生物治疗的体内模型。本研究通过SCID鼠皮下接种高转移性人乳腺癌细胞，同时腹腔内植入人PBL，建立了同时具有人免疫系统和人乳腺癌的复合动物模型，从整体动物模型的角度观察了中药复方癌复康等干预措施对SCID小鼠人乳腺癌自发性肺转移及免疫重建的影响，目前国内外类似报道较少。本研究显示癌复康+免疫重建组成瘤潜伏期明显长于其余3组，癌复康组和免疫重建组成瘤潜伏期均长于模型对照组,癌复康组与免疫重建组比较差异无统计学意义。表明人PBL的植入和中药癌复康均能使SCID小鼠成瘤潜伏期延长，抑制肿瘤生长，具有一定的抗肿瘤转移的作用，并能促进SCID小鼠的免疫重建，但癌复康组抗转移作用优于免疫重建组，癌复康与免疫重建结合效果更明显。

综上所述，中药癌复康能延长人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s接种SCID鼠成瘤潜伏时间，促进SCID小鼠的免疫重建，具有一定的抑制肿瘤生长和抗肿瘤转移的作用，其可能是通过提高机体免疫功能而防治乳腺癌的复发与转移，具体作用机制有待今后进一步研究。

[参考文献]

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[7]刘晓，范萍，王水，等． 小鼠人乳腺癌自发肺转移模型的建立[J]. 中华实验外科杂志，2003，20(7)：661-662

Effect of Aifukang on the human breast cancer lung metastasis and immune reconstitution in severe combined immunodeficiency mice

ZHU Huayu, ZHONG Shaowen, LI Yujie, WU Yuansheng

(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120，Guangdong, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effect of Aifukang on spontaneous lung metastasis and immune reconstitution of severe combined immunodeficiency (SCID) mice orthotopic transplantation model of human breast cancer. Methods 40 cases of SCID mice were randomly divided into 4 groups, the spontaneous lung metastasis model of human breast cancer was established by inoculation of high metastatic breast cancer cell line (MDA-MB-435s) on the second breast fat pad of left side of the abdomen in mice, and inoculation amount was 0.2 mL. After inoculation, the animals were treated with normal saline 10 mL/(kg·d) by intragastric administration in the model control group, 1 times per day; and with Aifukang 3.6 g/(kg·d) diluted with normal saline 10 mL by intragastric administration in the Aifukang group, 1 times per day; and with human peripheral blood lymphocytes 4×107/0.5 mL by intraperitoneal injection, and then received normal saline 10 mL/(kg·d) by intragastric administration in immune reconstitution group, 1 times per day; and with human peripheral blood lymphocytes 4×107 by intraperitoneal injection, and Aifukang 3.6 g/(kg·d) diluted with normal saline 10 mL by intragastric administration in the combine group, 1 times per day. The tumor volume, growth rate and tumor metastasis were observed in each group. Results The latent period of tumor formation of the combine group were obviously longer than those of the other three groups (all P<0.05), and which of the Aifukang group and immune reconstitution group were significantly longer than that of model control group (all P<0.05). The tumor growth rate of the blank control group was markedly faster and the tumor volume was markedly larger than those of the other three groups (all P<0.05); the tumor growth rates of Aifukang group and immune reconstitution group were similar (P>0.05), and of the combine group was the slowest (P<0.05). The human breast cancer spontaneous lung metastasis inhibition rate of the Aifukang group, the immune reconstitution group and the combine group was 64.7%, 38.4% and 84.8% relatively, there were significant difference between the three groups (P<0.05). Conclusion Aifukang can prolongs the latent period of tumor formation tumorigenic period in the SCID mice injected with MDA-MB-435s, and promotes the immune reconstitution in SCID mice. It has certain effect on inhibition of tumor growth and metastasis.

Key words:breast cancer; Aifukang; human breast cancer cell line MDA-MB-435s; severe combined immunodeficiency; mouse; immune reconstitution

[收稿日期]2015-12-01

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)15-1597-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.001

[基金项目]广东省自然科学基金课题(07300287)；广东省科技计划项目(2012B031800422)；广州中医药大学创新基金项目(2005c060)；广东省中医药局科技项目(2007066)；广东省中医院中医药科学技术研究专项名医工作室项目(E194)

[作者简介]朱华宇，女，博士，副主任医师，主要从事中西医结合治疗乳腺癌研究。