金荞麦提取物对COPD大鼠血清炎症因子和NF-κB表达的影响

唐艳芬，高　想，蒋凤荣，郭　胜，苏成程，侯海慧

(1. 南京中医药大学南通附属医院，江苏 南通 226001；2. 南京中医药大学，江苏 南京 210023)



金荞麦提取物对COPD大鼠血清炎症因子和NF-κB表达的影响

唐艳芬1，高想1，蒋凤荣2，郭胜1，苏成程1，侯海慧1

(1. 南京中医药大学南通附属医院，江苏 南通 226001；2. 南京中医药大学，江苏 南京 210023)

[摘要]目的观察金荞麦提取物对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血清炎症因子和核因子NF-κB的影响，探讨其治疗COPD的可能机制。方法采用改良烟熏法复制SD大鼠COPD模型，将造模成功大鼠随机分为模型组，金荞麦水提取物低、高剂量组，金荞麦醇提取物低、高剂量组，每组6只；另取6只正常大鼠作为正常组。正常组和模型组灌胃生理盐水，高剂量组给予水提物或醇提物10 g/kg(相当生药10倍)灌胃，低剂量组给予水提物或醇提物5 g/kg(相当生药5倍)灌胃，均1次/d，持续灌胃21 d。放射免疫法测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平，免疫组织化学法检测气管组织中核因子NF-κB表达情况。结果模型组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明显高于正常组(P均<0.05)；金荞麦水提物低剂量组、水提物高剂量组、醇提物低剂量组、醇提物高剂量组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明显低于模型组(P均<0.05)；与金荞麦水提物同等剂量组比较，醇提物组下降更显著(P>0.05)。模型组NF-κB表达阳性个数显著高于正常组(P<0.05)，金荞麦各提取物组NF-κB 表达阳性个数明显低于模型组(P均<0.05)，其中金荞麦醇提物高剂量组NF-κB 表达阳性个数最少。结论金荞麦水提物和醇提物均可下调NF-κB的表达，抑制COPD大鼠炎症反应，延缓COPD的发展。

[关键词]金荞麦；慢性阻塞性肺疾病；细胞因子；核因子

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。研究发现炎症细胞、炎症递质及细胞因子参与了气道壁的受损和肺组织的破坏[1]。近年来对COPD的研究不断深入，发现中医药辨证施治可对COPD发生发展的多个层次、多个环节发挥效应[2]，为COPD的防治提供了新的思路和方法。金荞麦水剂为南京中医药大学南通附属医院制剂，临床用于治疗COPD急性加重患者疗效较好[3-5]，但其作用机制尚不明确。本研究通过观察金荞麦提取物对COPD大鼠血清炎症因子及核因子NF-κB表达的影响，探讨了其治疗COPD的机制。现将结果报道如下。

1实验资料

1.1动物3月龄SD雄性大鼠38只，SPF级，体质量(200±10)g。南京中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(苏)2012-0042，动物质量合格证号：0012537。

1.2试剂肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)放免试剂盒由北京华英生物有限公司提供，抗体由美国B&R公司提供，引物由南京生物工程有限公司合成，其他化学试剂均为分析纯。

1.3金荞麦提取物制备金荞麦饮片(南通三越中药饮片有限公司，批号：20120128)60 ℃干燥8 h，粉碎，过100目筛，混匀，加70%乙醇100 L浸泡12 h，热回流提取2 h，过滤；重复提取2次，合并提取液，回收溶剂至无醇味；后加三氯甲烷提取，水液继续用水饱和正丁醇提取，得到三氯甲烷提取液，水饱和正丁醇提取液和水提取液，分别回收溶剂，真空干燥至浸膏，得到水提物和醇提物。

1.4实验方法随机选取32只大鼠，参照《医学动物实验方法学》，采用改良烟熏法复制COPD模型：将大鼠置于特制的50 cm×50 cm×50 cm的烟室中，将刨花锯末、烟叶各20 g点燃熏烟，2次/d，每次30 min，持续30 d，在实验第7,15天，以3%戊巴比妥45 mg/kg 腹腔麻醉后，仰卧位固定大鼠，行颈部脱毛，做颈部正中切口并分离颈前肌，暴露气管，向气管内注入脂多糖(LPS，10 mg/瓶，购自美国Sigma公司，用无菌注射用水制成水溶液1 mg/mL)200 μL,完毕后迅速将大鼠直立旋转10～20 s，使生理盐水均匀分布于肺部。另选取6只大鼠作为正常组，置于正常无烟环境中饲养，第7,15天同样手术，向气管内注入无菌生理盐水200 μL。于造模30 d处死2只大鼠判断造模是否成功。将30只造模成功大鼠随机分为模型组、金荞麦水提物低剂量组、金荞麦水提物高剂量组、金荞麦醇提物低剂量组、金荞麦醇提物高剂量组，每组6只。于造模结束后第2天起，正常组和模型组灌胃生理盐水10 mL/kg，高剂量组给予水提物或醇提物10 g/kg(相当生药10倍)灌胃，低剂量组给予水提物或醇提物5 g/kg(相当生药5倍)灌胃，均1次/d，持续灌胃21 d。

1.5检测指标

1.5.1血清TNF-α、IL-6、IL-8水平实验结束后，取动物血清，放射免疫法检测血清TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1.5.2气管组织中NF-κB表达情况采用免疫组织化学方法检测。实验结束后，处死动物，取出支气管和气管置于10%甲醛溶液中，常规脱水、切片。将石蜡切片用PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min；PBS冲洗，每张切片加1滴3%过氧化氢阻断溶液,以阻断内源性过氧物酶的活性,室温下孵育10 min；PBS冲洗，每张切片加1滴的非免疫性动物血清,室温下孵育20 min；甩去血清,每张切片加1滴的第一抗体(1∶100)，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min；甩去PBS液,每张切片加1滴生物素标记的第二抗体(生物素山羊抗兔IgG),室温下孵育10 min；PBS冲洗3次，每次3 min；甩去PBS液,每张切片加l滴SABC，室温下孵育20 min；PBS冲洗3次，每次3 min；甩去PBS液,每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察3～10 min；阳性反应为胞浆中出现棕黄色颗粒，并在高倍视野下计算100个细胞中阳性细胞数，选3个高倍视野计算均值。

2结果

2.1各组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平模型组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明显高于正常组(P均<0.05)；金荞麦水提物低剂量组、水提物高剂量组、醇提物低剂量组、醇提物高剂量组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明显低于模型组(P均<0.05)；金荞麦水提物与醇提物同等剂量组比较，醇提物组下降更多，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05 ；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组气管组织中NF-κB表达情况正常组有极少量棕黄色颗粒，模型组大量棕黄色颗粒，金荞麦水提物低、高剂量组有一定量棕黄色颗粒，金荞麦醇提物高剂量组有少量棕黄色颗粒。见图1～6。正常组、模型组、金荞麦水提物低剂量组、金荞麦水提物高剂量组、金荞麦醇提物低剂量组、金荞麦醇提物高剂量组NF-κB表达阳性个数分别为(3.83±0.75)个/100个、(14.00±1.79)个/100个、(11.00±0.89)个/100个、(6.33±0.82)个/100个、(9.67±0.52)个/100个、(5.83±0.75)个/100个。模型组NF-κB表达阳性个数显著高于正常组(P<0.05)，金荞麦各提取物组NF-κB表达阳性个数均明显低于模型组(P均<0.05)，其中金荞麦醇提物高剂量组NF-κB表达阳性个数最少。

图1　正常组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

图2　模型组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

图3　金荞麦水提物低剂量组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

图4　金荞麦水提物高剂量组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

3讨论

COPD发病机制尚不清楚,目前认为该病以气道、肺实质和肺小血管的慢性炎症为特征,病理改变包括慢性炎症及支气管、肺的反复损伤和机体不恰当修复而导致的结构改变。近年来大量研究表明TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子在COPD的发病中有一定作用[6-7]。IL-8主要来源于单核细胞、血管内皮细胞、T淋巴细胞，具有广泛的生物学活性[8]，是重要的白细胞趋化因子，主要吸引中性粒细胞(PMN)，通过与表面特异性受体结合，导致其趋化、变形，脱颗粒反应，释放弹性蛋白酶、组织蛋白酶等，引起严重的组织损伤。而弹性蛋白酶的释放又能诱导气道上皮细胞IL-8基因的表达，导致IL-8的进一步分泌，形成气道内的“炎性循环”，造成组织损伤，引起气道壁增厚和管腔狭窄，导致气流阻塞。TNF-α是一种强有力的致炎因子，其能激活炎性白细胞，尤其是巨噬细胞和PMN，可以刺激其释放更多的氧和氮基团以及其他细胞因子，如IL-6、IL-8和其他炎性细胞趋化因子[8]，这些递质能破坏肺的结构和/或促进PMN炎症反应[9]。本实验结果显示，模型组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明显高于正常组，提示这些细胞因子与COPD气道炎症密切相关。金荞麦水提物低、高剂量组和醇提物低、高剂量组血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明显低于模型组；水提物与醇提物同等剂量比较，醇提物组下降更多，但差异无统计学意义。提示金荞麦水提物及醇提物均可降低血清TNF-α、IL-8、IL-6水平，具有一定的抑制COPD气道炎症的作用，相同提取方法以高剂量组作用明显，不同提取方法等剂量组比较差异无统计学意义。

图5　金荞麦醇提物低剂量组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

图6　金荞麦醇提物高剂量组气管组织中NF-κB表达情况(×200)

NF-κB是重要的转录因子,其参与多种细胞因子和炎症递质的转录调控及表达，在免疫细胞的活化、分化、增殖以及各种炎症、细胞凋亡、应激反应当中均具有非常重要的功能，广泛参与COPD肺内多种因子的调控，其可以通过诱导多种细胞因子如IL-6、TNF-α、IFN-8等而可能引发“炎症瀑布”效应[10]。研究发现,NF-κB p65在气道上皮细胞中的表达与气道气流受限程度、COPD病情严重程度呈正相关[11]。本研究结果显示，模型组NF-κB表达水平显著高于正常组，金荞麦各提取物组NF-κB表达水平明显低于模型组，其中金荞麦醇提物高剂量组NF-κB表达水平最低。提示金荞麦提取物能够在一定程度上抑制NF-κB的表达，进而推断其能够减少下游各炎症因子的分泌，从而截断了患者的炎症反应，能够延缓COPD疾病的发展。

综上所述，金荞麦水提物和醇提物均可下调NF-κB的表达，抑制COPD大鼠炎症反应，相同提取方法以高剂量组作用明显，醇提物组较水提物组作用明显。结合COPD为多因素、多因子参与的发病特点, 推测转录因子可能是COPD发病中多种递质因子表达的基本转录调控因子，金荞麦提取物通过抑制NF-κB表达而抑制COPD大鼠的气道炎症，在目前COPD尚无特效治疗的情况下,通过激活或抑制NF-κB的表达, 以提高或降低某种递质或因子的表达来治疗COPD不失为一种可尝试的、新的思路和方法。

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Effect of the Wild Buckwheat Rhizome Extract on the serum inflammatory cytokines and the expression of NF-κB in chronic obstructive pulmonary disease model of rats

TANG Yanfen1, GAO Xiang1, JIANG Fengrong2, GUO Sheng1, SU Chengcheng1, HOU Haihui1

(1. Nantong Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nantong 226001, Jiangsu, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of the Wild Buckwheat Rhizome Extract on the serum inflammatory cytokines and the expression of NF-κB in chronic obstructive pulmonary disease model of rats, and explore the therapeutic mechanism for COPD. Methods The COPD model of SD rats was reproduced by improved smoke method, and then the successful model rats were randomly divided into model group, low (LAE group) and high (HAE group) dose group of aqueous extract of Wild Buckwheat Rhizome, low (LEE group) and high (HEE group) dose group of ethanol extract of Wild Buckwheat Rhizome, 6 rats in each group, another 6 rats were taken as normal group. The animals were treated with normal saline by gavage in the normal group and model group, and with water or ethanol extract of 10 g /kg (10 times drug) in the high dose groups, and water or ethanol extract of 5 g/kg (a drug 5 times) in the low dose groups, all 1 times per day, continuous treated for 21 days. The levels of serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin -6 (IL-6) and interleukin -8 (IL-8) were measured by radioimmunoassay, and the expression of NF-κB in tracheal tissue were detected by immunohistochemical method. Results The serum levels of TNF-α, IL-6 IL-8 in the model group were significantly higher than those in the normal group (all P<0.05); the serum levels of TNF-α, IL-6 IL-8 in the LAE group, HAE group, LEE group, and HEE group were significantly lower than those in the model group (all P<0.05). There was no significant difference in the levels between the same dose of ethanol extract and aqueous extract groups (all P>0.05). The expression of NF-κB in the model group was significantly higher than that in the normal group (P<0.05), the expressions of NF- κB in the extract groups of Wild Buckwheat Rhizome were significantly lower than those in the model group (all P<0.05), and the levels in the HEE group was the lowest. Conclusion The extraction of Wild Buckwheat Rhizome can reduce the expression of NF-κB, inhibit the inflammatory response in COPD rats and improve the lung pathomorphism changes.

Key words:Wild Buckwheat Rhizome; chronic obstructive pulmonary disease; serum Cytokine; nuclear factor

[收稿日期]2015-09-15

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)15-1600-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.002

[基金项目]江苏省中医药局中医药科技专项课题(LB09113)

[作者简介]唐艳芬，女，主任医师，研究方向为慢性阻塞性肺疾病及肺源性心脏病。