青海上北山林场野生桃儿七根部内生真菌群落组成及多样性研究

宁祎　李艳玲　周国英　杨路存　徐文华

[摘要]该研究通过应用第二代测序技术（NGS），即高通量测序方法测序青海野生桃儿七根内真菌宏基因组ITS 1区，并依据RDP中设置的分类阈值对处理后的序列进行物种分类，鉴定内生真菌的群落组成。研究结果显示，测序结果经过质量控制共获得有效条带22 565条，依据97%的序列相似性做聚类相似性分析，获得全部样品的可分类操作单元（OTUs）共517个，RDP分类依据08的分类阈值鉴定出的全部真菌可归类为13纲、35目、44科、55属。3个样品LD1，LD2，LD3中共同的优势属真菌为Tetracladium属（所占比例分别为3549%，6855%，1296%），样品的香浓多样性指数和辛普森多样性指数分别在175～292，011～032。研究结果表明，青海上北山林场野生桃儿七根内内生真菌具有较高的多样性和较复杂的群落组成，蕴含着丰富的内生真菌资源，且高通量测序技术对于研究植物内生真菌群落组成及多样性具有显著的优势。

[关键词]桃儿七；内生真菌；高通量测序；群落组成；多样性

[Abstract]High throughput sequencing technology is also called Next Generation Sequencing （NGS）， which can sequence hundreds and thousands sequences in different samples at the same time In the present study， the cultureindependent high throughput sequencing technology was applied to sequence the fungi metagenomic DNA of the fungal internal transcribed spacer 1（ITS 1） in the root of Sinopodophyllum hexandrum Sequencing data suggested that after the quality control， 22 565 reads were remained Cluster similarity analysis was done based on 97% sequence similarity， which obtained 517 OTUs for the three samples （LD1， LD2 and LD3） All the fungi which identified from all the reads of OTUs based on 08 classification thresholds using the software of RDP classifier were classified as 13 classes， 35 orders， 44 family， 55 genera Among these genera，the genus of Tetracladium was the dominant genera in all samples（3549%， 6855% and 1296%）The Shannon′s diversity indices and the Simpson indices of the endophytic fungi in the samples ranged from 175～292， 011～032， respectivelyThis is the first time for applying high through put sequencing technologyto analyze the community composition and diversity of endophytic fungi in the medicinal plant， and the results showed that there were hyper diver sity and high community composition complexity of endophytic fungi in the root of ShexandrumIt is also proved that the high through put sequencing technology has great advantage for analyzing ecommunity composition and diversity of endophtye in the plant

[Key words]Sinopodophyllum hexandrum； endophytic fungi； high throughput sequencing； community composition； diversity

doi：10.4268/cjcmm20160712

桃儿七Sinopodophyllum hexandrum又名鬼臼、小叶莲等，属小檗科Berberidaceae桃儿七属Sinopodophyllum多年生草本植物，我国珍稀濒危物种，属国家三级保护植物。桃儿七分布在海拔2 700～4 300 m的林下或灌丛中，在我国主产于青海、甘肃、四川西部、西藏、云南西北部、陕西等地，此外尼泊尔、不丹、印度北部、巴基斯坦、阿富汗东部和印控克什米尔等地也有分布[1]。桃儿七作为中国传统中药具有悠久的用药历史。藏医以桃儿七果实入药，可调经活血、保胎、消肿、止痛。中医以其根及根状茎入药，具有祛痰止咳，抗肿瘤，抗免疫等作用[2]。近年来国内外学者对其深入研究发现，桃儿七根茎内含有较高的抗肿瘤活性物质——木脂素类化合物，如鬼臼毒素、4′去甲基鬼臼毒素等。植物中获取天然活性化合物治疗人类疾病，在现代医学史上占据着重要的地位，但随着现代社会的高速发展，带来的一系列问题导致某些包括野生植物资源在内的自然资源日益枯竭。因此，许多的科研工作者将生产天然活性化合物的视角转向了微生物方向，桃儿七内生真菌即为当今的研究热点之一。

内生真菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖在宿主植物体内，而不引起植物发生明显病变的一类真菌总称[3]。目前认为，地球上生存的所有高等植物都有内生真菌的定殖，纯培养研究结果显示，定殖的内生真菌种类少则十几种多则上百种。内生真菌与宿主植物之间的相互作用也多种多样，如抗逆促生、抗虫害、抗病害、环境修复及产活性产物等等[4]，因此研究宿主植物体内的内生真菌群落组成和多样性对研究内生真菌与宿主间的相互作用具有重要的生态学意义。

高通量测序技术（HTS）起始于2005年，又被称为第二代测序技术[5]，此技术能够一次并行对几百万到上千万条的DNA序列分别进行测序，对于研究环境样品中微生物群落组成具有巨大的应用价值。目前高通量测序技术在水环境及土壤微生物群落研究领域已得到广泛应用。但此技术应用在植物内生真菌群落组成中的研究却少有报道[68]，尤其在民族药用植物宿主内的内生真菌群落组成的研究中尚未见报道。目前对于桃儿七植株内生真菌群落组成的研究仅局限于纯培养模式开展，取得了一些现有的结论[911]，但此方法具有一定的局限性，据统计利用培养基分离的内生真菌种类总数不超过全部真菌总数的1%，甚至更低，因此利用纯培养模式研究宿主植物内生真菌的群落组成，其结果将会低估不能培养分离的内生真菌对宿主植物的贡献[12]。本文通过第二代测序技术——高通量测序对桃儿七根内内生真菌的群落组成及多样性进行了研究，主要的目的有以下3个方面：①运用高通量测序技术掌握青海上北山林场桃儿七内生真菌的群落组成及多样性；②比较免培养测序结果与前人研究的纯培养分离结果之间的关联差异；③探讨桃儿七优势种内生真菌的生态学功能。基于以上研究目的，期许发现青海野生桃儿七宿主内新的有价值真菌资源，为抗肿瘤药物的获取开辟一条新途径，以期为其工业化生产奠定基础。

1材料与方法

11采样

于2014年9月初，样品采挖自青海省乐都区境内的引胜沟上北山林场（102°23′540′′，36°42′172′′），海拔2 835 m。采样时选取成年健康植株3株，根据随机取样原则，取样的株距在30～50 m。样品采挖后连带根际土一并装入干净塑料袋，置入便携式保温箱中，编号标记后带回实验室备用。

12样品预处理

新鲜样品采回后，洗净桃儿七根部表面泥土，自来水下冲洗30 min，取出样品置于无菌烧杯中用大量无菌水漂洗，待样品干燥后置于无菌操作台中。无菌操作台中的样品表面灭菌处理操作参照纯培养模式下[13]的灭菌过程，具体方法如下：将样品浸入70%乙醇1 min，再浸入5%的次氯酸钠5 min，无菌水漂洗3次，待样品干燥后剪切成小段置于无菌2 mL离心管中保存在冰盒中送样。样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

13DNA提取及引物筛选

样品中真菌总DNA的提取采用OMEGA公司生产的真菌提取试剂盒，依据生产商的说明提取。提取的DNA用Qubit 20 DNA检测试剂盒检测DNA浓度，琼脂糖凝胶检测DNA完整性。实验选取3对真菌特异性引物2F/2R[14]，3F/3R[15]，ITS1/ITS2[16]，分别对应扩增ITS区域的58S，ITS2，ITS1区。随机挑选一个样品LD1进行扩增，每对引物设置4个生物学重复，筛选出最佳引物。

14高通量平台测序

PCR扩增引物为真菌特异性引物扩增真菌的ITS1区，扩增时引物融合测序平台的通用标签序列以区分样品，引物序列为：前置引物5′CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA3′，后置引5′GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC3′。其中，斜体序列为特异性引物序列，其他序列为添加的测序标签序列。PCR扩增产物用Illumina Miseq 2×300测序平台进行双端测序分析。

15数据处理

151序列质量控制对测序所得的序列进行质量控制，质量控制包括3个部分，首先根据标签序列区分样本后，将样本中所得的标签序列去掉；其次，去除较短的片段序列，短片段的定义为小于50 bp；最后，应用Prinseq软件去除低复杂度的序列。最终得到的各样本序列长度均在200 bp以上。

152OTU聚类及RDP分类根据质量控制所得的优质序列，将多条序列按其序列间的距离根据聚类软件Uclus对它们进行聚类，序列间的距离相似性阈值设置为097，聚类为不同的操作分类单元（OTUs）。随后应用RDP classifier软件基于Nave Bayesian assignment算法，对OTU聚类结果中的全部序列计算每条序列在属水平上的RDP分类阈值，一般设置阈值为08归类为一个属，依此对各样品中的菌群进行分类。

153群落组成分析在形成的OTU聚类结果基础上，对样品进行Alpha多样性分析，通过计算样本的丰富度指数、辛普森指数、香浓指数、Chao1指数、ACE指数来衡量样本的物种多样性。根据分类学分析结果，绘制样品菌群分布条形图，比较样品间的菌群组成差异。

2结果

21引物筛选

3对引物扩增结果见图1，1～4，5～8，9～12对应的引物分别为2F/2R，3F/3R，ITS1/ITS2（每对引物设置4个生物学重复）。比对Marker可知，引物2F/2R扩增出的条带均大于600 bp，引物3F/3R扩增出的条带均小于200 bp，引物ITS1/ITS2扩增出的条带有2条分别对应300，400 bp。根据Illumina Miseq 2×300测序平台自身特点，引物2F/2R扩增出的条带过大，不能上机测序，引物3F/3R扩增的条带较短，测序结果可信度较差。引物ITS1/ITS2扩增区域为ITS1区，条带范围在300～400 bp，符合Illumina Miseq 2×300测序平台的测序条件。因此，确定ITS1/ITS2引物为本研究的最佳引物，具体见14。

22质量控制

质量控制前共获得序列54 856条，质量控制后共获得优质序列22 565条，其中LD1，LD2，LD3分别为7 194，6 629，8 742条，全部序列长度均大于200 bp（=257 bp）。

23OTU聚类及RDP分类

质控后获得的序列，依据97%的序列相似性获得的可分类操作单元（OTUs）517个。其中样品LD1，LD2，LD3获得的OTUs数目分别为305，253，138个。RDP分类全部OTUs可划分为13纲，35目，44科，55属。样品LD1可划分为10纲，20目，26科，31属，LD2可被划分为11纲，22目，25科，31属，LD3可被划分为9纲，17目，21科，27属。

24物种分布

在门和属2个层次上对3个样品进行群落组成分析。除去未鉴定出的真菌外，3个样品均为子囊菌门和担子菌门2个门，其中LD1，LD2样品中子囊

菌门占绝对优势分别为7608%，7294%，样品LD3中担子菌门占绝对优势为8039%。在属水平上进行分析，除去未鉴定出的真菌群落，所示样品中，见图2。排名前3的优势属真菌（所占比例之和超过全部的60%）LD1为Tetracladium，Hymenoscyphus，Pseudogymnoascus（ 3549%，1945%，1433%），样品LD2中优势属真菌为Tetracladium，unclassified_Sebacinaceae，Aspergillus（6855%，195%，122%），样品LD3中优势属真菌为unclassified_Sebacinaceae，Tetracladium，Pseudogymnoascus（8014%，1296%，273%）。3个样品LD1，LD2，LD3中共同的优势属真菌为Tetracladium属，所占比例分别为3549%，6855%，1296%（=3647%）。

25α多样性

3个样品Alpha多样性分析指数见表2。样品的香浓多样性指数在175～292，辛普森指数在011～032。其中样品LD3的辛普森指数高于样品LD1，LD2，样品LD1，LD2的香浓多样性指数高于样品LD3，各样品测序文库的覆盖率均达到98%以上。

3讨论

31青海野生桃儿七内生真菌群落组成及多样性

目前，高通量测序技术研究宿主植物和环境中内生真菌的群落结构及多样性趋势，呈现逐渐上升的势头[6]。本研究OTUs聚类多样性研究结果与前人的研究结果类似[68]，例如通过454测序仪高通量测序研究夏威夷地区的铁心木叶内内生真菌，不同生长环境类型下的大果砾叶内内生真菌及美国西海岸不同品系和生长类型的杜鹃属叶内内生真菌，结果显示，分别获得OTUs单元4 253，689，488个。本研究通过应用Illumina Miseq 2×300测序平台共发现OTUs 单元517个，表明青海上北山林场的野生桃儿七根内具有较高的真菌OTU丰度。

一般认为不同气候区域内的宿主植物内生真菌群落多样性存在差异。如Arnold A E等[16]认为热带地区的宿主植物内生真菌的丰富度及系统发育多样性均高于温带和寒带地区。但Zimmerman N B等[6]对夏威夷处于不同海拔高度（100～2 400 m）同一宿主植物铁心木内生真菌454测序研究，结果表明低海拔地区与高海拔地区的内生真菌多样性并没有显著差异。李海燕等[17]通过对云南白马雪山5种优势种植物内生真菌进行研究，得出内生真菌的香浓多样性指数在125～270，表明在高海拔严寒地区植物内生真菌同样具有较高的多样性分布。青海上北山林场位于青藏高原东北部，属于高海拔、高辐射、年均温较低的高寒地区。研究结果显示，桃儿七根内内生真菌的香浓指数在175～292，与上述研究结果相类似，表明位于高海拔高寒地区的桃儿七植物内同样含有较高的内生真菌多样性丰度。有研究表明，传统的纯培养方法分离出的真菌类群低估了内生真菌群落的多样性[12]。本研究通过免培养高通量测序技术手段共获得OTUs 单元517个，全部真菌可归类为13纲、35目、44科、55属。前人通过传统的培养基分离方法对桃儿七内生真菌的群落组成进行研究，取得了一定的结果，但分离到的真菌群落多样性普遍较低，如毕江涛等[9]对宁夏泾源县境内的野生桃儿七内生真菌纯培养分离，共得到可培养真菌49株，归属于2目、3科、9属。张琨等[10]对陕西太白山境内的野生桃儿七内生真菌分离培养，获得内生真菌26株归属于2目、3属。李海燕等[11]对云南中甸地区的野生桃儿七内生真菌分离培养，获得菌株28株可归属为5目、6科、9属。据目前所知，全部区域隶属于青藏高原的青海地区野生桃儿七内生真菌纯培养分离研究虽然未见相关报道，但本研究应用免培养高通量测序技术手段所得结果与前人纯培养分离其他地域的桃儿七内生真菌结果相比，免培养高通量测序技术得出的内生真菌类群无论种属和数量均远高于纯培养研究模式。这表明应用纯培养分离模式研究植物内生真菌的群落组成确实具有一定的局限性，桃儿七根内蕴含着丰富的内生真菌资源可供开发利用，免培养高通量测序手段对于研究植物内生真菌的群落结构组成具有显著的优势。

32优势属内生真菌生态学功能探讨

在属水平上，所有的真菌类群可以被分成4大类：3个样品中均出现、只在2个样品中出现、只出现在1个样品中及未鉴定出的类群。由表1可知，3个样品中所有真菌可被划分为55个类群。其中3个样品中均出现的有8个属，丰度为457%，只在两个样品中出现的有14个属，丰度为306%，只出现在一个样品中的有31个属，丰度为70%（其中Hymenoscyphus属真菌只出现在样品LD1中，单个样品中丰度1945%，占总体丰度645%，另外30个属，总体丰度为055%），未鉴别出的有2个属，丰度为167%。研究结果显示，在所有样品中均出现的8个属真菌类群却贡献了样品中接近一半的丰度值（457%）。前人研究表明，宿主植物能够显著影响内生菌的群落结构[1819]。宿主植物通过组织内的微环境与内生真菌发生相互作用，其能够通过分泌合成一些代谢产物来间接调控内生真菌的群落组成。同样，内生真菌群落中各真菌共处于同一生态位空间中，其相互竞争也是导致群落结构发生变化的内在因素[20]。本研究结果显示，8个优势属真菌占据群落中将近一半的丰度值，这种群落结构组成必然是真菌群落与宿主植物相互作用及菌群间相互竞争的结果，丰度值较大的优势种真菌可能在与宿主植物相互作用中扮演者重要的角色。只存在于一个样品中的30个稀有种真菌（055%）可能是偶然定殖到宿主植物体内的伴生种，它们的定殖可能具有一定的随机性。

本研究3个样品中共同的优势属真菌为Tetracladium。Tetracladium属真菌的记录多以水生丝孢菌居多[2122]，大多来源分离自水中的凋落叶及泡沫中，具有分解凋落物的功能[23]。也有一些学者从不同的宿主植物根部纯培养分离到Tetracladium属的内生真菌类群[2326]。如Nemec等[24]首次从草莓属的根部分离到一株Tetracladium属内生真菌T marchalianum。Watanabe T等[25]也从龙胆属植物和草莓属植物的根部分离到Tetracldium属的内生真菌新种T setigerum。此后，Sati S C等[23，26]陆续从不同的宿主植物根部分离到Tetracladium属的内生真菌。本研究通过高通量测序首次在桃儿七根部检测到Tetracladium属内生真菌，并且是作为优势属类群存在。目前关于此类内生真菌定殖在宿主植物内发挥的生态学功能尚不清楚。桃儿七生境喜阴，多分布在溪边沟渠的林下或稀疏灌木中，林下枯枝凋落物丰富，土壤水分含量大。有学者认为植物根部可能充当一个Tetracladium属真菌季节性周转的容器，当叶等凋落物不宜被分解利用时发挥降解功能[27]。本研究的采样时间为9月初，此时采样地包括桃儿七在内的各植物物种均处于生长末期，枝叶即将枯落。因此桃儿七根部可能季节性存储了此类具有降解功能的内生真菌类群，土壤微生物分解凋落物不力时，菌体进入环境分解腐殖质供次年生长循环利用，关于此点推论若条件允许将对桃儿七根内菌群的季节动态加以研究验证。

此外，研究中还发现了一些常见的内生真菌类群。如青霉属、木霉属、曲霉属等均为常见的内生真菌类群，曾被报道为不同环境群落中的优势属内生真菌[17]。油瓶霉属、外瓶霉属、短梗霉属、肉座菌属、Cadophora sp真菌以及一些粪壳菌目、柔膜菌目、炭角菌目、锤舌菌纲、座囊菌纲的真菌也作为不同地区不同宿主的内生真菌被广泛报道[20，2833]。研究中还发现一些可能是作为植物病原菌的一些真菌类群如白粉菌属和高氏白粉菌属等，这些类群真菌可能为桃儿七的病原性真菌被检测出来。值得注意的是，截盘多毛孢属真菌在应用纯培养分离时也被分离培养出来，对其初步的研究表明，其能够合成宿主桃儿七根部提取物抗肿瘤药物鬼臼毒素类化合物。

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[责任编辑吕冬梅]