4种黄酮类中药有效成分BCS分类及吸收机制的初步研究

李慧芳　张冬　曲文君　王海霖　刘洋　阿里穆斯　崔箭　董政起

[摘要]该研究根据生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS），研究山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素等4种黄酮类中药有效成分的溶解性和渗透性，并对其进行BCS分类；同时对其吸收机制进行研究。参照《中国药典》2010年版中溶解度测定方法对4种黄酮类成分进行溶解度的测定，采用体外细胞培养法建立Caco2细胞模型，利用MTT法筛选出合适的给药浓度进行细胞转运实验来检测表观渗透系数（Papp）以判断渗透性，并根据BCS对其进行分类；采用Caco2细胞模型，选择高、中、低3组不同浓度化合物进行双向转运实验研究吸收机制。实验表明山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素等具有低溶解性、高渗透性，属于BCSⅡ类，其中山柰酚为主动转运吸收机制，而橙皮苷、芹菜素、染料木素等为被动吸收。该研究针对中药黄酮类单体有效成分的特性，对其溶解性及渗透性的评价方法进行了摸索，为进一步完善中药生物药剂学分类体系提供了理论依据。

[关键词]黄酮类中药有效成分；生物药剂学分类系统（BCS）；吸收机制；溶解性；渗透性

[Abstract]The solubility and permeability on four kinds of flavonoids （kaempferol， hesperidin， apigenin， genistein） were test according to the theory of biopharmaceutics classification system （BCS）， and their absorption mechanism The solubility was investigated by the method in determination of solubility of "Chinese Pharmacopoeia 2010" To detect appearance permeability of compounds mentioned above， the appropriate concentrations were selected by the MTT method in cell transfer experiments in Caco2 cell model， which established by in vitro cell culture method Therefore， these compounds were classified with BCS according to solubility and permeability In addition， to explore absorption mechanisms， the experiments in three different concentrations of compounds in high， medium and low in bidirectional transformation methods in Caco2 cell model contacted The study indicated that all of kaempferol， hesperidin， apigenin， genistein have the characteristics in low solubility and high permeability， which belong to BCSⅡ， and the absorption mechanism of kaempferol was active transportation Whereas， hesperidin， apigenin， genistein were passive transportation In this study， it carried out initial explorations on establishment of determination for solubility and permeability in flavonoids， and provided theoretical reference for further research on BCS in traditional Chinese medicine

[Key words]flavonoids； biopharmaceutics classification system （BCS）； absorption mechanism； solubility； permeability

doi：10.4268/cjcmm20160707

黄酮类化合物（flavonoids）是传统中药中所含的一类重要天然有机化合物，黄酮类化合物结构多种，如黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、二氢黄酮类等[1]，因此其溶解度和渗透性也存在差异[2]。口服给药是最方便、广泛、容易被人们所接受的给药途径，符合中医药传统给药方式[3]。口服给药后化合物经胃肠道吸收进入血液循环，在化合物吸收过程中溶解性和渗透性是关键[48]，其次是肠道吸收[9]。因此，研究一种中药有效性成分成药性时了解其溶解性及渗透性尤为重要，化合物只有被溶解才能透过胃肠道膜，只有良好的渗透性及脂溶性时才能透过脂质膜；其次是了解化合物吸收机制，以便更准确地知晓化合物的吸收特性及吸收过程[1012]。

生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system， BCS）是根据化合物自身溶解性及肠渗透性的高低对化合物进行分类的一种科学框架或方法。此分类系统基于化学化合物理化性质为前提所提出。目前，刘丹[13]，刘维[14]等根据BCS提出对中药组分及多成分体系下对中药生物药剂学分类理论，但是针对中药单体成分系统研究其溶解性和渗透性及其吸收机制的研究鲜有人报道。本研究选择4种极具代表性的黄酮类中药有效成分，芹菜素（黄酮类）、山柰酚（黄酮醇类）、染料木素（异黄酮类）、橙皮苷（二氢黄酮类），以BCS理论为指导对其进行分类，并研究其吸收机制，为黄酮类中药有效成分成药性提供参考。

1材料

高效液相色谱仪（安捷伦公司），电热恒温水浴锅（HHS型，上海博讯实业有限公司），旋涡振荡器（VORTEX5型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），CO2培养箱（五洲东方科技发展有限公司），倒置显微镜（奥林巴斯公司），超净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），荧光/化学发光分析仪（Thermo公司），微量振荡器（MM1型，金坛市正基仪器有限公司），电热恒温水浴锅（HHS型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂），电阻仪（MillcellERS，美国Millipore公司），高压灭菌罐（上海博讯实业有限公司）。

山柰酚（批号K131116）、芹菜素（批号K140310）、橙皮苷（批号K141222）均购于西安开来生物工程有限公司；染料木素购于吉林中医药研究所。

甲醇、乙腈（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司）；Caco2细胞（北京协和医学院基础所细胞中心）；MEM NEAA（GibcoinvitrogenTM公司）；MEM/EBSS（Hyclone Thermo公司）；胰酶、胎牛血清（Hyclone Thermo公司）；双抗（UK InvitrogenTM公司）；二甲基亚砜（Sigma公司）；荧光素（天津市光复精细化工厂研究所）。

2方法

21溶解性实验

211对照品溶液配制分别精密称取山柰酚、芹菜素、橙皮苷、染料木素对照品21，32，28，58 mg，依次用甲醇溶液定容至25，25，50，50 mL，即得储备液。

精密吸取山柰酚储备液稀释至质量浓度分别为0840，0420，0210，0168，0126，0084 mg·L-1的系列对照品溶液；精密吸取芹菜素储备液稀释至质量浓度分别为0640，0320，0192，0128，0064 mg·L-1的系列对照品溶液；精密吸取橙皮苷储备液稀释至质量浓度分别为14000，8400，5600，2800，1400，0280 mg·L-1的系列对照品溶液；精密吸取染料木素储备液稀释至质量浓度分别为11600，5800，2900，1160，0580，0116 mg·L-1的系列对照品溶液。

212溶解性测定方法参照《中国药典》2010年版中溶解性的测定方法[15]：精密称取化合物10 mg 置于具塞离心管中，加入5 mL蒸馏水（pH 68），样品试管置于37 ℃水浴，每5 min振荡30 s，观察30 min后于5 000 r·min-1离心10 min，取上清液4 mL于12 000 r·min-1离心10 min，再取上清液过022 μm滤膜，适当稀释后取样20 μL于HPLC分析其浓度；设6个重复。

213溶解性检测条件采用高效液相法来检测山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素的溶解性，色谱条件如下。

色谱柱均为Agilent TCC18（46 mm×250 mm，5 μm），保护柱均为SEPC18（80 mm×10 mm）；流动相依次为乙腈05%磷酸水溶液38∶62，乙腈水20∶80，乙腈水35∶65，乙腈01%磷酸水溶液36∶64；检测波长依次为276，283，340，254 nm；流速依次为1，08，08，1 mL·min-1；柱温均为25 ℃；进样量均为20 μL。

214标准曲线的建立及方法学考察标准曲线：将211项中的标准溶液，按上述色谱条件进样测定，以峰面积（Y）对对照品浓度（X）进行线性回归，见表1；结果表明山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素在下述浓度范围内有线性关系。

方法学考察：取高、中、低3个浓度的山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素对照品溶液，于1 d内重复测定5次，考察日内精密度，连续测定5 d，考察日间精密度，见表2；结果表明，3个浓度的精密度RSD 均小于2%，说明该分析方法的精密度符合方法学要求。

22渗透性测定方法

在研发的初期阶段，可以采用结肠腺癌细胞系（Caco2细胞）或人工膜测定药物的透过，从而预测药品从肠腔进入血液的渗透性[16]。本研究采用体外细胞培养法建立Caco2细胞模型，根据MTT实验选择出适合实验的抑制率小于10%的高、中、低3个浓度的化合物，见表3，并进行转运实验。

筛选标准为若受试药物的细胞抑制率<10%，则可作为合适剂量进行实验。由表3可知，所选浓度的受试化合物的细胞抑制率均小于10%，则均可作为适宜初始浓度进行实验。

培养21 d后，将细胞从培养箱中取出，吸去小室内外的培养液，用预热至37 ℃的Hank′s液清洗细胞2次，最后一次放置在培养箱中孵育20 min。取出细胞，测量并记录TEER。在细胞绒毛面（apical，AP）侧加入不同浓度的受试化合物，基底面（basolateral，BL）加入新鲜的Hank′s液，记录时间，在加入化合物后的第15，30，60，90，120 min分别从BL侧吸取100 μL的液体样品于15 mL离心管中并补充同体积的Hank′s液，并对100 μL样品于HPLC测定含量。2 h后，再次测量并记录TEER。

TEER =ΔR×A

其中，ΔR为实际电阻，A为转运膜面积，为112 cm2。

根据转运实验的结果计算Papp，并判断化合物的渗透性。

Papp=（dQ/dt）/（A×C0）

其中，Papp为表观渗透系数（cm·s-1）；dQ/dt为单位时间化合物转运量（μg·s-1）；C0为受试化合物的初始浓度（mg·L-1），见表3。

23吸收机制研究

利用Caco2细胞模型，选择高、中、低3组不同浓度化合物进行双向转运实验，将各浓度的化合物溶液05 mL加到细胞AP侧作为供给池，同时BL侧加入空白的Hank′s平衡盐溶液15 mL作为接受池，分别在15，30，60，90，120 min取BL侧溶液100 μL于HPLC分析其含量，观察4种黄酮类化合物从细胞AP侧到BL侧的转运。另外，将各浓度的化合物溶液15 mL加到BL侧作为供给池，同时AP侧加入空白Hank′s平衡盐溶液05 mL作为接受池，分别在上述取样时间点取BL侧溶液100 μL于HPLC分析其含量，观察其从BL侧到细胞AP侧的转运。

3结果与分析

31溶解度及溶解性分类

生物药剂学分类系统规定高溶解性的药物是指在37 ℃下，pH在1～75，剂量与溶解度的比值小于250 mL的药物。将剂量（mg）除以溶解度（g·L-1）得到的比值（以体积mL为单位）与FDA的标准250 mL相比，即可判断药物溶解度的高低。由于BCS理论之前均是针对化学药，中药没有明确的给药剂量，所以根据《中国药典》2010年版中的近似溶解度的判定方法来判定药物的溶解性，认为凡水溶解度高于001 g·mL-1，即达到略溶标准的都是溶解性高的药物。

溶解度（S）是药品的一种物理性质。根据《中国药典》2010年版中规定，将药品的近似溶解度以下列名词来表示，如0000 1 g·mL-1

32渗透性判断

FDA推荐的测定渗透性的方法中以Caco2细胞判断化合物吸收难易的一般标准为[1718]：Papp<10×10-6 cm·s-1为吸收较差的化合物，吸收率在0%～20%；Papp在10×10-6～10×10-6 cm·s-1为吸收中等的化合物，吸收率在20%～70%；Papp>10×10-6 cm·s-1吸收较好的化合物，吸收率在70%～100%。本文采用体外细胞培养法建立Caco2细胞模型，利用MTT法筛选出合适的给药浓度进行细胞转运实验，在规定时间点吸取BL侧溶液100 μL于HPLC分析其含量，根据转运实验的结果计算Papp，见表4。与内标物美托洛尔（1×10-6 cm·s-1）进行对比判断化合物的渗透性，结果显示山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素的Papp均高于内标物美托洛尔，表明上述4种黄酮类有效物质均有高渗透性。

33BCS分类

根据BCS分类系统，Ⅰ类，高溶解性、高渗透性；Ⅱ类，低溶解性、高渗透性；Ⅲ类，高溶解性、低渗透性；Ⅳ类，低溶解性、低渗透性[56]。判断上述4种黄酮类化合物的分类，均属于Ⅱ类。

34吸收机制

利用Caco2细胞模型，选择高、中、低3组不同浓度化合物进行双向转运实验，即HPLC分别测AP→BL侧与BL→AP侧转运量，见图1，2。考察不同时间点及不同的给药浓度时两侧转运量和的Papp的变化规律，见图3，分析其吸收机制。

根据图1，2可知，山柰酚随着时间增加，3浓度转运量不断增加，呈现时间依赖性；橙皮苷、芹菜素及染料木素随着时间增加，3浓度转运量不断增加，没有明显的饱和趋势。

根据图3可知，Papp随着给药浓度的增加在AP→BL方向和BL→AP方向均呈现出减小的趋势（P<005）。由此可见，山柰酚在吸收过程（AP→BL）中有浓度依赖性，可能受到转运载体介导，主要以主动转运的方式转运；而在分泌过程（BL→AP）中，无浓度依赖性。此外，3个浓度的表观渗透率Pratio均接近1且小于15（Pratio为Papp BL→AP与Papp AP→BL的比值），没有明显的方向性，不存在外排蛋白介导，所以山柰酚在人体内主要以主动转运的方式吸收。

橙皮苷、芹菜素及染料木素3种黄酮类化合物的高、中、低3浓度的橙皮苷Pratio均接近1，双向转运结果显示无明显的方向性，认为不存在外排蛋白介导，所以橙皮苷在人体内主要以被动转运的方式吸收。

4讨论

由于FDA指导原则中是针对新药注册申报的要求，而本文所选的模型药物仅仅是对其成药性进行初步判断，暂时无模型药物的临床使用剂量作为参考，所以本研究溶解性的判断方法并未选用剂量参数进行折算。另一方面，现行BCS经典理论是主要针对化学化合物，大部分为可分解的离子型化合物，因此不论是给药剂量还是溶剂的pH都规定了明确的标准。但是，目前中药BCS分类中判断各类天然产物及其单体的溶解性高低没有明确标准，因此本文选择根据《中国药典》2010年版中的近似溶解度的判定方法来初步判断中药单体有效成分的溶解性。侯成波等[19]分别在pH 10，40，74的缓冲盐中进行葛根素的溶解度实验，结果表明不同pH背景下葛根素溶解度不同，其在pH 74时其溶解度最高。但目前尚未报道对中药黄酮类在不同浓度下的溶解度的研究。因此参考FDA工业指导原则中规定，需要在不同pH条件下的溶解度数据以准确描述化合物的pH溶解度曲线，如当化合物的pKa在3～5时，溶解度可在pH=pKa，pH=pKa+1，pH=pKa-1，pH=1，175条件下进行测定[6]。本实验在探索山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素等在不同pH缓冲盐的溶解度时首先在pH 68水溶液下检测，在后续的研究中考虑不同pH下的溶解度。

FDA推荐的测定渗透性的方法有人体化合物动力学数据、人体肠道灌流实验、原位动物模型数据或有效的单层细胞培养[6]。FDA规定，高渗透性的化合物是指在胃肠道稳定的情况下，能够达到90%以上可被吸收的化合物，此数值可以间接地通过化合物在人体内的吸收程度来获得，即指相当于给药剂量被吸收的分数，而不是指系统的生物利用度。大部分化学化合物（如绝对生物利用度大于90%）利用一种方法就足以判断渗透性类别，但有些化合物不能用一种方法来判断渗透性，这时最好用2种方法来进行验证。本文选择以Caco2单层细胞透过性来判断药物的渗透性，便捷、快速且准确，适合药物的早期成药性评价。经初步判断成药性好的候选药物，如进一步进行临床前研究，可考虑增加在体和离体动物实验进行多角度的渗透性评价，为后期的临床试验奠定基础。

山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素溶解度和渗透性实验结果表明其有低溶解性，高渗透性特质，属于BCSⅡ类。一般来说，BCSⅡ类化合物（如环孢霉素、灰黄霉素、依曲康唑）的生物利用度受其溶解度的限制，即使较小的溶出速率的增加都会使生物利用度大幅提高。根据NoyesWhitney方程，影响化合物溶出速率的因素有扩散系数、有效表面积、扩散层的厚度、溶解度、溶解化合物的量及溶出介质的体积。因此在上述4种黄酮类有效成分成药性研究中通过处方前研究和处方设计可提高化合物溶解度，增加其有效表面积，从而提高化合物的溶出速率，改善其溶解性；常用的方法有晶型修饰，减小粒径，自乳化和制成无定型化合物。此外，当某化合物的Papp AP→BL与Papp BL→AP接近时，该化合物以被动扩散方式转运；Papp AP→BL明显大于Papp BL→AP时被小肠A侧膜的转运蛋白所转运；Papp BL→AP明显大于Papp AP→BL时，则被小肠A侧膜的外向型转运蛋白所外排。因此，山柰酚的吸收机制是主动转运；橙皮苷、芹菜素、染料木素的吸收机制是被动转运。

中药的口服使用是中医临床的主要手段，中药发挥疗效的机制，多数情况下与中药成分胃肠道吸收后，在机体相关部位产生作用有关。化学药的BCS在很大程度上推动了新药发现的进程，提高了新药开发的效率。借鉴化药发展经验，本课题组以BCS为理论指导，已初步对4种黄酮类化合物进行生物药剂学分类研究，并分析了其吸收机制，为其成药性提供了理论依据。但是建立黄酮类有效成分的BCS，在后续的工作中不仅需要完善黄酮类化合物的种类还需改善检测溶解性及渗透性实验模型，并为建立中药生物药剂学分类系统提供参考依据。

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[责任编辑孔晶晶]