戊型肝炎病毒感染研究概况

李文贵，段新慧

(云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)



专论与讲座

戊型肝炎病毒感染研究概况

李文贵，段新慧

(云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)

摘要：戊型肝炎病毒(HEV)以肝脏为主要靶器官，人感染后表现典型的病毒性肝炎，多呈急性经过。肝脏移植患者、混合感染HIV者及接受化疗的血液病患者可引起慢性感染，迅速导致肝硬化。戊型肝炎的症状及病变与基因型有密切相关。HEV含3个开放阅读框架(ORF)，ORF2编码病毒衣壳蛋白，包裹病毒基因组形成新的病毒粒子，ORF3编码的蛋白可辅助转运新病毒粒子至宿主细胞膜。HEV感染可引起机体的有效免疫应答，自然杀伤细胞(NK)和T细胞介导HEV感染免疫应答中起关键作用。妊娠期间免疫系统的功能和性激素水平的波动，直接影响到孕妇体内的HEV复制，加剧了急性肝衰竭发生的频率。

关键词：戊型肝炎病毒；病毒性肝炎；致病机制;免疫应答

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的危害较大的病毒性肝炎之一[1]。在卫生条件差的地区，基因1型和基因2型HEV在人类之间传播,通过粪-口途径，通常是通过受污染的水，据报道也有输血或垂直传播的[2]。多为散发，偶尔可暴发。在发达国家，基因3型和基因4型HEV常从动物宿主传给人，但仍有许多感染难以确定来源。猪是重要的储存宿主，鹿、兔、猫鼬等也可能是宿主。近年来，由于诊断技术和筛选策略的进步，报道的散发病例数不断增加。此外，基因3型HEV可引起免疫功能低下的患者发生慢性肝炎并引起肝硬化。目前对HEV的致病机制还缺乏了解。随着对该病毒的细胞培养技术方面的突破，感染性cDNA克隆和HEV复制子的构建，以及猪、鸡、兔和长爪沙鼠等动物模型的建立，在很大程度上推动了HEV体内复制、致病机理等领域的研究[3-4]。此外，最近在免疫抑制病人例如肝脏移植病人、白血病患者和HIV晚期免疫缺陷患者的研究也取得一些进展。

本文对近年来人感染HEV后的临床症状、病理变化，病毒基因组特点及其复制机理、靶器官和免疫应答机制等方面的进展进行综述。

1人感染HEV的症状

人感染HEV后表现的症状及病变等与所感染的基因型有密切的关系。发展中国家主要流行基因1型，表现为自限性，持续数周。在2周～6周的潜伏期后，出现发热，恶心、腹痛、呕吐、厌食、乏力、肝肿大等，40%的患者发生黄疸。HEV感染的病死率很低，但感染孕妇的死亡率可高达20%，患有慢性肝病的患者也可发生高死亡率。发达国家人群中主要流行基因型3型和4型，常呈急性感染。发达国家发生的本土急性戊型肝炎与发展中国家出现的急性型一样，不过患者多为中老年男性，这些患者中有不少HEV感染的老年人常被误诊为药物性肝损伤。英格兰对47例符合药物性肝损伤诊断标准的患者进行HEV检测，除去19个患者没有保留血清，还有6份(12.8%)HEV基因3型阳性[5]。此外，发达国家的戊型肝炎多呈散发，没有出现过暴发，但有过食品点源性人群聚集性发生。75%患者出现黄疸，其他常见的症状包括恶心、发热、乏力、关节痛、呕吐、腹泻、腹部疼痛等。丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平通常达1 000 IU/L～3 000 IU/L。

越来越多的研究表明，HEV除具急性感染、自限性的特点外，也会出现慢性感染，导致渐进性肝损伤和肝硬化[6]。慢性感染目前仅见于基因3型，且见于肝脏移植患者，少数为混合感染HIV及接受化疗的血液病患者。有研究表明慢性感染常见于CD2、CD3和 CD4 T细胞数显著下降和严重免疫抑制患者。多数患者表现为自限性，4周～6周内症状消失，生化指标恢复正常。少数患者会出现神经症状，诊断时很容易被误诊。有研究表明HEV 3型与4型致病性存在差异。如日本的研究发现4型感染引起的转氨酶更高，法国也有研究表明4型感染症状更严重[7]。

HEV感染除肝脏的病毒性肝炎表现外，还可引起格林巴利综合征(Guillain-Barré syndrome)、多发性神经根炎、面神经麻痹、神经痛性肌萎缩、急性横贯性脊髓炎和急性脑膜脑炎等HEV相关神经综合征；在HEV1型和3型感染所致的急性和慢性感染者中，还观察到肾功能受损，有膜增生性和膜性肾小球肾炎两种组织学病变；以及血小板减少、再生障碍性贫血等肝外表现，其发生机制尚需进一步研究[8]。

2病理变化

目前关于人感染HEV后所表现病理变化的资料很少。从有限的资料看，HEV感染肝脏病变与急性病毒性肝炎相似。观察到的病变主要包括汇管区有重度多形核细胞和淋巴细胞浸润；肝小管过度增殖，胆汁淤积，实质细胞腺体样转化；肝细胞排列紊乱，有的肿胀,呈泡沫样；中度到重度界面性肝炎，有些还出现胆管炎；门静脉因炎症浸润而扩张,可见多形核白细胞,淋巴细胞,巨噬细胞；炎性细胞外溢至周围的实质组织等[8]。对自然感染猪进行的前瞻性研究表明，感染猪肝脏中的病变分为两期。Ⅰ期病变主要为汇管区淋巴细胞浸润或散在性浸润，轻度多发性病灶；Ⅱ期病变可见于12周龄～15周龄猪，表现汇管区中度或严重的淋巴细胞浸润，实质中单核细胞集聚，不同年龄猪病灶发生部位不同，主要表现为中度肝炎[9]。人工感染猪可观察到肝脏和淋巴结轻度或重度肿大,实质中炎性细胞浸润，肝细胞严重空泡变性、肿胀、坏死，以及窦状隙中枯否氏细胞浸润等组织学病变[1]。

3HEV的基因组及其复制

HEV是单股正链RNA病毒。HEV的基因组结构主要由5′ 端的非结构区(NS)和3′端结构区(S)组成。编码3个开放读码框(open reading frame,ORF)，其中ORF1基因起始于5′端非编码区的末端，编码非结构蛋白(non-structural proteins,NSPs)，有5 082个碱基，可编码一个含有1 693个氨基酸的多肽链。ORF1可以被分为包括甲基转移酶区(methyltransferase,MT)、半胱氨酸蛋白酶区(papain-like cysteine proteases,PCP)、高变区(hyper-variable region,HVR)、解旋酶区(helicase,Hel)、RNA依赖的RNA聚合酶区(RNA-dependent RNA polymerases,RdRp)和X、Y区。ORF2编码衣壳蛋白，含有660个氨基酸，分子质量为72 ku。其多肽序列富含精氨酸并有3个N-糖基化位点。ORF3长约360 nt，与ORF2重叠的部分约为300 nt，编码一种与细胞骨架结合的磷酸蛋白。5′端和3′端各有一个非编码区(NCR)。5′端有7甲基鸟甘酸帽结构，3′端含有150个～200个腺苷酸残基组成的多聚腺苷(poly A)尾。HEV基因组中的连接区域(junction region,JR)将ORF1与ORF2、ORF3分隔。两个顺反应元件(CRE)均为茎环结构，第1个CRE与3′末端的ORF2及非编码区重合；第2个CRE在JR区[3]。在复制过程中，HEV衣壳蛋白通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)，HSC70或其他受体附着到细胞表面后，启动了病毒的入侵与复制，HSP90和GRP78可能参与了病毒离子穿膜过程。ORF2肽结合试验结果表明，ORF2 的C末端可能通过在细胞表面与热休克同源蛋白70(HSC70)结合调节病毒的侵入过程。此外，已证实HSPGs也是细胞表面病毒受体之一。病毒脱壳后，基因组进入细胞，HEV基因组5′NCR中的7甲基鸟苷酸帽(7-methylguanosine cap structure)募集40 S核糖体亚单位启动帽子依赖病毒蛋白翻译(图1)[5]。病毒非结构蛋白从基因组RNA转录。病毒RdRp产生一种负链、可复制的RNA中间体，此中间体作为模板生产正链的子代病毒基因组。已证实HEV RdRp在复制体系中有活性，而负链病毒RNA中间体在感染动物中也曾被检出。RdRp有可能与HEV基因组3′NCR的顺式反应元件(cis-reactive elements,CREs)结合，这在HEV复制中起着关键的作用。HEV基因组接合区(junction region,JR)的CRE在次基因组(subgenomic，SG)RNA合成中起着关键作用。结构蛋白OPF2和小ORF3蛋白从次基因组翻译后，ORF2包裹基因组RNA形成新的病毒粒子，在ORF3协助下转运至细胞膜。

4HEV的靶器官

肝脏是HEV的主要靶器官。无论自然或是人工感染的猪均可观察到肝脏有轻微损伤。猪静脉接种HEV后20 d～27 d,病毒可存在于肝脏、结肠、淋巴结(肠系膜淋巴结和肝门淋巴结)、脾脏等器官组织中[10]。人工感染猪接种HEV后14 d,肾脏、小肠、脾脏、肾脏、唾液腺、扁桃体和肺中均可检测到HEV正链及负链RNA,说明HEV可能在除肝脏以外的其他器官复制增殖。最近一项研究[11]比较了通过直接接触和人工静脉注射途径将HEV感染猪后体内病毒分布的差异，发现静脉注射后27 d和直接接触后31 d可在最长肌、二头肌、股头肌和髂腰肌中检测到病毒RNA的存在。这些器官可检测出HEV RNA可能只是病毒血症导致的,但仍可造成猪肉产品的HEV污染。直接接触感染组60%(3/5)的猪可从尿液中检测出HEV,而静脉注射的猪尿液未能检测到HEV。显然，粪便及尿液中排出的HEV可促进病毒在动物之间更快的传播。可见，静脉接种途径虽然较粪-口途径或直接接触途径具有更高的有效性,但未能反映出HEV的自然感染情况。

图1　戊型肝炎病毒的复制与装配

5免疫应答机理

人类和动物的研究结果均表明，肝细胞的损害并非病毒复制所致，而是免疫反应的结果，HEV感染引起的异常免疫应答，使机体出现自限性急性病毒性肝炎(AVH)和急性肝衰竭(ALF)在内的各种临床类型。如临床上观察到抗体上升和病毒载量下降的同时，患者反而出现黄疸便是佐证。

5.1细胞免疫应答

自然杀伤(NK)细胞和T细胞介导在HEV感染的免疫应答中起关键作用[12]。Srivastava R等[6]研究发现，CD4+/CD8+T细胞受ORF2蛋白刺激后，患者CD4+单核细胞的比例高于对照组。CD4+细胞总数扩大，分泌IFN-γ、TNF 和IL-4的CD4+/CD69+和CD8+/CD69+T细胞的比例未发生变化。然而，患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)培养上清中的IFN-γ及其mRNA转录水平都有升高，IL-2和TNF-ɑ无变化，表明分泌IFN-γ的CD4+T细胞不属于Th1或Tp，和NK细胞一样与HEV致病有关系。Husain M M等[13]用流式细胞术，对急性戊型肝炎患者和健康成年对照组外周血单核细胞中的T细胞亚群进行计数，并用酶联免疫斑点(ELISPOT)法评价HEV特异效应性T细胞的应答。结果发现，患者CD8+T细胞和CD4+/CD8+T细胞数明显增加。此外，重组ORF2和ORF3处理后，分泌IFN-γ的PBMCs的比例增加。表明急性肝炎患者效应性T淋巴细胞被激活，从而帮助清除体内的HEV。Kamar N等[14]在HEV慢性病人和易患急性肝功能衰竭的高危人群中发现CD2+、CD3+、CD4+T淋巴细胞数量有明显的减少，这表明HEV非典型临床症状可能与机体免疫抑制相关,免疫抑制可能导致HEV的特异性免疫反应减弱和病毒持续感染。

HEV感染还可引起核转录因子κB(NF-κB)功能的改变。NF-κB作为各种炎症反应的三条重要转导通路之一，集中在其对免疫反应及炎症反应的调控，包括介导机体对病原体入侵的天然免疫及适应性免疫应答，T、B细胞的发育、增殖及炎症反应等方面的影响。此外，NF-κB在应对感染的协调中具有广泛的转录调控细胞旁路，可决定感染细胞的存活或死亡。细胞处于静息状态时，NF-κB二聚体(p50/p65 异型二聚体或p50/p50同型二聚体)与没有活性的抑制因子IκB结合在一起，以无活性的形式存在于细胞质中。后者将IκB蛋白的两个亚基(IκBɑ、IκBβ)氨基末端丝氨酸磷酸化，使IκBɑ降解，NF-κB和IκB分离，NF-κB活化。Prusty B K等[15]研究了HEV感染有关急性病毒性肝炎(acute viral hepatitis，AVH)和急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)的妊娠妇女及健康对照体内NF-κB 亚基p50 和 p6的DNA结合活性的结果发现，与中度肝炎患者和对照组相比，ALF患者肝细胞和PBMCs中NF-κB的DNA结合活性较高，但检测不到活化的NF-κB p65。Surjit M等[16]观察到在人肝癌细胞中异源表达的ORF2蛋白可稳定IκBα亚基，p65亚基的核定位的同时减少，抑制了NF-κB的活性。进一步研究发现ORF2蛋白可直接作用于F-box 蛋白，β转导重复相容蛋白(βTRCP)；而ORF2的过表达降低了IκBα与SCFβTRCP复合物成分SKP1和CUL1的联系。表明ORF2蛋白可以抑制宿主细胞NF-κB活性。此外，NF-κB还可调控IL-8表达，IL-8的表达在HEV感染后也显著上调。已知IL-8与诱发肿瘤、转移和血管再生等有关[17]。孕妇尤其南亚次大陆和非洲的孕妇对HEV高度易感，感染后多出现急性肝衰竭,病死率达15%～30%，原因可能与孕期免疫系统的功能和性激素水平变化有关[18]。胎盘屏障在保护胎儿免受母体免疫系统攻击的同时，也影响了机体针对病原体的免疫应答。在怀孕期间，发生了由Th1转为Tp主导的免疫反应，或称“Tp偏移(Tp bias)”，这一过程被认为可抑制巨噬细胞活化从而有助于保护胎儿。Th1型反应表现为IFN合成增加，有助于抗寄生虫感染；而Tp型倾向于产生IL-4、IL-6和IL-10等抗炎细胞因子，以及加大抗体分泌量。NK细胞也有关系。日本学者对111名孕妇、126名产妇和86名非妊娠期健康妇女的调查发现，NK细胞活性在妊娠第3期(29周～40周)明显降低，第1孕期(1周～12周)和产后的第1个月期相对较高。纽约市妊娠期病毒免疫研究结果也发现，在第3期是NK细胞活性最低。最近，Kumar A等[19]研究发现，与没有怀孕的妇女相比，妊娠妇女感染HEV引起的急性病毒性肝炎和暴发性肝衰竭患者的病毒载量、TNF-α、IL-6、 IFN-c 和 TGF-b1水平显著增高，TNF-α、 IL-6 和 IFN-c水平与病毒载量、血清胆红素和凝血酶原时间呈显著正相关。表明细胞因子与HEV感染后的严重程度及不良妊娠结局有关系。Borkakoti J等[20]也证实HEV病毒载量是影响妊娠妇女感染后严重程度的因素之一。

5.2体液免疫

HEV感染后，产生的IgA 是肠道黏膜免疫的重要效应分子，可作为人体外部第一道屏障，阻止病毒吸附到黏膜上皮细胞，同时结合正在感染上皮细胞的病毒，并通过分泌作用将病毒送回到上皮细胞外。IgM 出现早，但消失也快，可作为戊型肝炎病毒急性期感染的指标。在急性感染患者中，HEV IgM抗体于感染2周左右可检出，随后迅速上升至6周～8周达到峰值后逐渐下降，20周左右消失。但 Gotanda Y等[21]对献血人群调查时还发现谷丙转氨酶明显升高并出现病毒血症的献血人员，戊型肝炎病毒IgM阳性率很低。这说明现有的IgM诊断试剂尚不能满足戊型肝炎病毒感染的临床诊断和流行病学筛查的需要。抗戊型肝炎病毒IgG抗体感染后2周～4周出现并逐渐升高，12周～16周达峰值，可持续数月甚至数年。IgG 出现相对较晚，可用于流行病学调查，以研究人群感染率、流行规律和免疫保护的时间及效果，是临床戊型肝炎病毒诊断的重要指标。Yang Y等[4]在基因4型猪源HEV人工感染长爪沙鼠，没有观察到明显临床症状，但血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(T-BIL)显著升高，感染后第3周可检测到IgG，第6周达高峰。而Hong Y等[22]用人源基因1型HEV感染长爪沙鼠则观察到疲劳、被毛粗乱等表现。

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Advance in Hepatitis E Virus Infection

LI Wen-gui，DUAN Xin-hui

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China)

Abstract:Liver is the main target organ of Hepatitis E virus (HEV),with the typical acute viral hepatitis in human cases .Majority of chronic HEV cases are diagnosed in liver transplant recipients,co-infection patients of HEV with HIV, and in hematological patients treated with anticancer chemotherapy,chronic infection usually could rapidly result in cirrhosis.Symptoms of hepatitis E are closely related to genotype of HEV. HEV contains three open reading frame (ORF), the ORF2 capsid protein packages the genomic viral RNA and assembles new virions,while ORF3 protein facilitates the trafficking of the virion to host cell membrane.HEV infections usually activate an effective immune response,natural killer (NK) cell and T-cell-mediated immune response of HEV infection play a key role.The mediating shifts in the immune system,pregnancy-associated hormones during pregnancy may directly influence viral replication in pregnant women and contribute to a high incidence of acute liver failure.

Key words:Hepatitis E virus;viral hepatitis;pathogenesis;immune response

文章编号:1007-5038(2016)04-0099-05

中图分类号:S852.659

文献标识码:A

作者简介：李文贵(1973- )，男，云南禄劝人，副教授，博士，主要从事兽医公共卫生学研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(31160495)

收稿日期：2015-10-13