藏绵羊瘤胃中产纤维素酶芽胞杆菌的分离鉴定

彭忠利，邹智坤，曾　泽，张　斌，岳　华，冯浩媛，汤　承

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)



藏绵羊瘤胃中产纤维素酶芽胞杆菌的分离鉴定

彭忠利，邹智坤，曾泽，张斌，岳华，冯浩媛，汤承*

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

摘要：2013年10月，采集10份四川阿坝藏族羌族自治州若尔盖藏绵羊瘤胃内容物。采用高温水浴，富集培养的方法进行芽胞杆菌的分离，并使用刚果红染色法进行产纤维素酶芽胞杆菌的初步筛选，共获得101株产纤维素酶芽胞杆菌。通过16 S rRNA序列测定对分离出的芽胞杆菌鉴定出3种不同的芽胞杆菌，其中短小芽胞杆菌78株、蜡样芽胞杆菌14株、枯草芽胞杆菌9株。本研究鉴定了藏绵羊瘤胃中芽胞杆菌的组成，为进一步利用芽胞杆菌开发藏绵羊源的益生菌奠定了基础。

关键词：藏绵羊；瘤胃内容物；产纤维素酶芽胞杆菌；分离鉴定

芽胞杆菌作为动物机体的益生菌，是一种相当完美的微生态饲料添加剂，具有帮助动物消化吸收，分泌多种肠道消化酶，提高饲料报酬，增强动物对疾病抵抗力，保持动物体内正常的胃肠道菌群平衡等作用[1-2]。杨伟平等[3]从藏香猪盲肠内容物中分离到1株产酶能力强的枯草芽胞杆菌，王炳晓等[4]从奶牛瘤胃液中分离出较强分解纤维素能力的苏云金芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。藏绵羊作为青藏高原所特有的养殖动物，长期生息在海拔3 000 m以上的高原牧区，其对严寒、空气稀薄等高原恶劣生态环境具有良好的适应能力[5]。藏绵羊作为一种反刍动物，在天然放牧的环境下，其瘤胃细菌在牧草的消化吸收具有重要的作用，在纤维素分解的途径中具有重要而特别的功能，研究它们的具体机理，对增强纤维素利用能力和发现藏绵羊瘤胃发酵规律都有重大意义。为此，本研究对来自四川阿坝藏族羌族自治州若尔盖县10份藏绵羊瘤胃内容物进行产纤维素酶芽胞杆菌的分离鉴定，为青藏高原藏绵羊瘤胃生理研究和微生物菌群结构提供了参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样本采集2013年10月，采集10份四川阿坝藏族羌族自治州若尔盖藏绵羊瘤胃内容物。采集方法为：无菌打开瘤胃后，取45 mL瘤胃内容物装入无菌采样管中，置于4℃样品箱运回实验室，立即进行分离培养。

1.1.2主要试剂TSA培养基，杭州微生物有限公司产品；增菌液，CMC-Na固体培养基和产纤维素酶筛选培养基，西南民族大学动物医学教研室自制；DNA Markers，北京天根公司产品；TaqDNA聚合酶(5 U/μL )、dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司产品；其他化学试剂由本单位实验室提供。

1.1.3主要仪器设备恒温培养箱，美国Thermoforma公司产品；高速离心机centrifuge 5804，德国Eppendorf公司产品；PCR仪my cyclerTM、核酸电泳仪powerpac universalTM、凝胶成像系统VerSa Doc2000，美国Bio-Rad公司产品；超纯水仪Milli-Q，法国Millipore公司产品；核酸蛋白检测仪DU800，美国Beckman公司产品。

1.2方法

1.2.1芽胞杆菌的分离参考文献[6]将采集的瘤胃内容物置于4℃冰箱保存，取20 mL经无菌纱布过滤振荡摇匀，加入20 mL PBS稀释，取2 mL稀释液加入8 mL生理盐水，摇匀后，置于80℃水浴20 min；取10%接种量接种于增菌肉汤中，37℃厌氧培养24 h～48 h；取1 mL增菌液，加入9 mL生理盐水倍比稀释至10-3、10-4、10-5，无菌涂布至CMC-Na平板和TSA平板，置于37℃厌氧条件和需氧条件分别培养24 h～72 h，挑取单菌落进行纯化。

1.2.2产纤维素酶的芽胞杆菌的筛选将纯化好的菌株点种至产纤维素酶菌株筛选培养基上，培养48 h～72 h；配制5 g/L的刚果红染液，利用它对筛选培养基染色30 min，倒掉染液并用水冲洗，加入适量50 g/L的NaCl溶液脱色30 min～60 min，筛选出产纤维素酶的菌株。将筛选出的菌株继续在TSA培养基纯化培养15 h，取新鲜菌体进行革兰染色并镜检。

1.2.3分离菌16 S rRNA的PCR鉴定 用改进CTAB法对初步筛选到的101株产纤维素芽胞杆菌进行DNA的提取[7]，根据已建立的芽胞杆菌的PCR检测方法[8]对提取的DNA进行检测，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列为：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC - 3′。对提取的DNA进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min。PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。用PCR产物纯化回收试剂盒,对PCR扩增产物进行纯化，纯化产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2结果

2.1产纤维酶芽胞杆菌的筛选

采用刚果红染色法检测芽抱杆菌产纤维素酶情况，共筛选到101株产纤维素芽胞杆菌。结果显示，具有产纤维素酶能力的芽胞杆菌在平板上生长出单菌落并且分泌出纤维素酶，分解菌落周围的羧甲基纤维素钠，刚果红因缺少大分子的羧甲基纤维素钠结合而被冲掉，菌落周围产生明显的显色圈(图1)。

2.2革兰染色结果

观察产纤维素酶芽胞杆菌在TSA培养基上面的菌落的生长情况(图2)，并且挑取新鲜菌落进行革兰染色(图3)。按菌落形态和菌体革兰染色形态大概分为3种：第1种：菌落形态圆形、菌落大、边缘不光滑、中间有隆起、乳白色不透明，革兰染色为蓝色、菌体较大、棒形、有芽胞；第2种：菌落形态圆形、菌落较大、光滑、边缘整齐、乳白色不透明，革兰染色为紫色、菌体较大、长棍形、有芽胞：第3种：菌落形态圆形、菌落大、边缘整齐、中间有凹陷、乳白稍有透明，革兰染色为紫色、菌体极小、短棒形、有芽胞。

图1　部分产纤维素酶细菌刚果红染色情况

2.3PCR鉴定结果

PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，电泳(图4)结果显示,扩增片段约为1 500 bp，与预期相符。用PCR产物纯化回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，纯化产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与GenBank中已收录芽胞杆菌相应的基因序列对比分析，发现101株分离芽胞杆菌中有短小芽胞杆菌78株、蜡样芽胞杆菌14株、枯草芽胞杆菌9株。

A.菌落形态圆形、边缘不光滑、中间有隆起、乳白色不透明；B.菌落形态圆形、光滑、边缘整齐、乳白色不透明；C.菌落形态圆形、边缘整齐、中间有凹陷、乳白稍有透明

A.The bacterial colony is circular,unsmooth in surface,convex in center,opaque milky white;B.The bacterial colony is circular,smooth,neat in edge,opaque milky white;C.The bacterial colony is circular,neat in edge,concave in center,milky white,slightly transparent

图2芽胞杆菌菌落形态

Fig.2The colony morphology ofBacillus

A.革兰染色为蓝色、棒状；B.革兰染色为紫色、长棒状；C.革兰染色为紫色、短棒状

A.Gram staining for blue,rod-shaped;B.Gram staining for purple,long rod-shaped;C.Gram staining for purple,short rod-shaped

图3芽胞杆菌显微镜下形态

Fig.3The microscopic morphology ofBacillus

M.DNA 标准DL 2 000;N.阴性对照;1.样品

M.DNA Marker DL 2 000;N.Negative control；1.Sample

图4分离菌的16 S rRNA 的PCR扩增结果

Fig.4PCR results of 16 S rRNA of isolated bacteria

3讨论

藏绵羊是我国特有的动物品种，可终年放牧，以饲草维持其正常的生长发育和繁殖。其瘤胃是代谢牧草纤维素的主要器官。在本研究中，从瘤胃分离出78株短小芽胞杆菌。蜡样芽胞杆菌14株，枯草芽胞杆菌9株。其中短小芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌是农业部规定可以饲喂动物的，具有很好的益生潜力。瘤胃中细菌数量巨大，种类极其复杂，芽胞杆菌可以被认为是瘤胃细菌的一类。邓慧媛[9]从奶牛瘤胃中分离到了短小芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌等8种芽胞杆菌。从本研究结果来看，短小芽胞杆菌可能是藏绵羊瘤胃共生菌。它适应了特定的气候和瘤胃的环境，可以更好发挥产酶效益，帮助藏绵羊消化和吸收纤维素。很多蜡样芽胞杆菌由于携带肠毒素基因，是条件致病菌，但也一部分蜡样芽胞杆菌同样可以被用作益生菌。Roos T B等[10]使用一种蜡样芽胞杆菌的变种，作为一个潜在的佐剂，用于提高抗牛疱疹病毒疫苗功效，在动物试验中发现，增加了机体IFN-γ、IL-12和IL-10的细胞因子mRNA水平，表明蜡样芽胞杆菌可以提高疫苗的功效，增强动物免疫力。

纤维素酶也是一种重要的饲料用酶制剂，它能帮助瘤胃消化纤维素，提高瘤胃对纤维素的降解率进而提高饲料利用率[11]。在自然界中存在着可以许多产生纤维素酶的微生物，包括真菌、细菌和放线菌，其中芽抱杆菌分泌的纤维素酶具有较强的活性。本研究筛选芽胞杆菌具有较强的产纤维素酶能力，为了解藏绵羊瘤胃中微生物组成提供参考，为进一步利用芽胞杆菌开发藏绵羊源的益生菌奠定了基础。

参考文献:

[1]任平,阮祥稳,赵文娟,等.产酶益生芽孢杆菌的筛选[J].江苏农业科学,2014,42(10):362-365.

[2]Imani Fooladi A A,Mahmoodzadeh Hosseini H,Nourani M R,et al.Probiotic as a novel treatment strategy against liver disease[J].Hepat Mon,2013,13(2):e7521.

[3]杨伟平,孟凡旭,马丽,等.藏香猪源纤维素分解菌的分离鉴定及酶学特性分析[J].动物营养学报,2014,26(3):620-629.

[4]王炳晓,柴同杰,苏鹏程,等.奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解菌的分离鉴定[J].西北农林科技大学学报：自然科学版,2009,37(3):35-42.

[5]兰道亮,王永,张诚民,等.藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析[J].西南民族大学学报，2014,40(4):482-484.

[6]吴敏峰,耿秀蓉,祝小,等.产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定[J].饲料工业,2006,27(20):21-24.

[7]廖永红,任文雅,孙宝国,等.米醋中蜡状芽孢杆菌DNA提取及其ERIC-PCR体系建立[J].中国食品学报,2011,11(4):7-13.

[8]张晓娟,宋萍.23株芽孢杆菌16 SrRNA基因序列扩增与系统发育分析[J].食品与发酵科技,2012,48(2):9-12.

[9]邓慧媛.奶牛瘤胃微生物分离及地衣芽孢杆菌对黄芪多糖转化影响[D].甘肃兰州：兰州理工大学,2013.

[10]Roos T B,de Lara A P,Dummer L A,et al.The immune modulation ofBacilluscereusvar.toyoiin mice immunized with experimental inactivated bovine herpesvirus type 5 vaccine [J].Vaccine,2012,30(12):2173-5177.

[11]Ko K C,Han Y,Choi J H,et al.A novel bifunctional endo-/exo-type cellulase from an anaerobic ruminal bacterium [J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,89(5): 1453-1462.

Isolation and Idenfication of Cellulase-producingBacuillusStrains in Tibetan Sheep Rumen

PENG Zhong-li,ZOU Zhi-kun,ZENG Ze,ZHANG Bin,YUE Hua,FENG Hao-yuan,TANG Cheng

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu，Sichuan,610041,China)

Abstract:In october 2013,10 Tibetan sheep rumen content samples were collected in a slaughter house of Ruoergai County,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture,Sichuan.Bacillus were isolated with the high temperature water bath and the method of enrichment culture.The preliminary screening of cellulase producing Bacillus were conducted by using Congo red staining.101 strains of cellulase producing Bacillus were obtained.Through the 16 S rRNA sequence determination,3 species of Bacillus were identified,including,78 strains of Bacillus pumilus,14 strains of Bacillus cereus,9 strains of Bacillus subtilis.In this stu-dy,the compositions of Bacillus in Tibetan sheep rumen were identified for further utilization of Bacillus from Tibetan sheep to develop the probiotics.

Key words:Tibetan sheep;rumen content;cellulase producing Bacillus;isolation and identification

文章编号:1007-5038(2016)04-0070-04

中图分类号:S852.6

文献标识码:A

作者简介：彭忠利(1964-)，男，四川巴中人，博士，主要从事动物营养与饲料学研究。*通讯作者

基金项目：四川省科技计划项目(2014JQ0044)；2015年四川省大学生创新创业活动(S201510656056)

收稿日期：2015-07-15