HPLC测定宫衣净酊中葛根素含量

朱永刚，崔东安，王　磊，王旭荣，张景艳，林　杰，杨志强，李建喜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)



HPLC测定宫衣净酊中葛根素含量

朱永刚，崔东安，王磊，王旭荣，张景艳，林杰，杨志强，李建喜*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)

摘要：为了建立宫衣净酊中葛根素的高效液相色谱(HPLC)测定方法,应用色谱柱为安捷伦Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(25∶75)，流速为1 mL/min，检测波长为250 nm，柱温为30℃。结果表明，在此色谱条件下，葛根素的线性范围为18.25 μg/mL～584.00 μg/mL(r=0.999 9，n=6)，平均回收率为108.83% (RSD=1.03%)。说明本方法简便、准确、重现性好，可以作为宫衣净酊的质量控制方法。

关键词：高效液相色谱；宫衣净酊；葛根素；含量测定

宫衣净酊是由葛根、益母草、红花等中药制成的酊剂，其临床功效主要有活血化瘀、促进胎衣排出、净化子宫、加快产后子宫复旧、促进产后繁殖性能的恢复。前期试验证实，宫衣净酊具有治疗奶牛胎衣不下的效果，治愈率达85.7%[1]。葛根为豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻等功效，由于中医临床炮制的方法不同，使用方法也有所不同。葛根素是葛根的主要成分之一，由于其性质稳定，因此选用葛根素作为宫衣净酊有效成分的含量控制指标之一。《中国兽药典》(2010年版)中录入了葛根中葛根素的HPLC含量测定方法[2]，但该方法样品制备步骤繁琐，不适宜于宫衣净酊中葛根素的含量测定。本文采用较为简便的方法对宫衣净酊中的葛根素进行处理和含量测定，以期为衣净酊的质量控制提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器Waters e2695 Alliance 高效液相色谱仪，美国Waters公司产品；Eclipse XDB-C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国安捷伦科技公司产品；超声波清洗器KQ-250型，昆山市超声仪有限公司产品；超纯水制备仪，力康公司产品；ME235S微量分析天平，Sartorius公司产品。

1.1.2药品葛根素对照品(中国食品药品检定研究所，批号：110752-201313)；宫衣净酊样品，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃省新兽药工程重点实验室研制，主要由葛根、红花、益母草等药组成，每瓶200 mL；甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)；纯化水自制；乙醇为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件色谱柱：安捷伦Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30℃；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速1 mL/min；检测波长250 nm。在上述色谱条件下，葛根素的典型保留时间为12.1 min，理论塔板数以葛根素峰计算不低于4 000。

1.2.2对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品5.84 mg，用甲醇制成每1 mL含584 μg的溶液作为对照品溶液。

1.2.3供试品溶液的制备精密量取宫衣净酊样品溶液2 mL，加甲醇稀释至10 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.4阴性对照溶液的制备取处方中不含葛根药材的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.5方法专属性试验按照1.2.1所述色谱条件，分别取宫衣净酊供试品溶液、阴性溶液以及葛根素对照品溶液进行HPLC分析。

1.2.6标准曲线的绘制精密量取葛根素对照品溶液，分别制备成18.25、36.5、73.00、146、00、292.00、584.00 μg/mL的浓度梯度对照品溶液。按照1.2.1所述色谱条件，取上述葛根素标准品溶液进行HPLC分析，以峰面积y相对应的标准品溶液浓度x进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.2.7精密度试验取同一宫衣净酊供试品溶液，重复进样6次，按照1.2.1所述色谱条件，测定其峰面积。

1.2.8稳定性试验取同一宫衣净酊供试品溶液，室温放置，于0、2、4、8、12、24 h进样，按照1.2.1所述色谱条件，测定葛根素含量。

1.2.9重复性试验取同一批宫衣净酊供试品溶液，按照供试品制备方法平行制备6份，按照1.2.1所述色谱条件测定葛根素含量。

1.2.10加样回收率试验精密量取同一批次已知含量的宫衣净酊样品溶液6份，每份1 mL，置于10 mL容量瓶中，分别加入与样品所含葛根素量相当的对照品，加700 mL/L乙醇溶液至刻度，摇匀。按制备供试品溶液的方法制备，并测定其含量，计算回收率。

回收率=(实测值-供试品中葛根素含量)/对照品葛根素加入量×100%。

2结果

2.1葛根素含量测定的标准曲线

葛根素线性回归方程：y=0.658 9x+0.398 9 (R2=0.999 9，n=6)，结果如图1所示。葛根素在18.25 μg～584.00 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2样品含量的计算方法

按标准曲线计算样品中葛根素含量的公式：x=C/V

x为样品中葛根素的含量(mg)；C为样品中色谱峰的面积积分值对应的葛根素的浓度(mg/mL);V为样品的体积(mL)。

图1　葛根素的标准曲线

2.3精密度试验

宫衣净酊样品中葛根素含量的RSD为1.025%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4稳定性试验

宫衣净酊中葛根素含量的RSD为0.9411%(n=6)，表明宫衣净酊供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.5重复性试验

宫衣净酊中葛根素含量的RSD为1.32%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.6加样回收率试验

宫衣净酊中葛根素的平均回收率为103.21%，RSD为1.76%(表1)，表明本试验具有良好的回收率。

2.7方法专属性试验

结果显示在该色谱条件下，其他成分不干扰葛根素的测定，可与其他成分达到基线分离(图2)。

表1　葛根素加样回收试验结果

3讨论

3.1提取方法的选择

由于宫衣净酊中乙醇含量为360 mL/L～400 mL，且含有羟基红花黄色素A等热不稳定性成分，因此《中国兽药典》中300 mL乙醇加热回流提取葛根素的供试品溶液制备方法并不适用于宫衣净酊样品中葛根素的提取。有文献报道用超声60 min提取葛根素效果最好[3]，本试验对供试品溶液提取方法进行比较，结果表明，直接加甲醇提取与超声振荡提取测定结果基本一致，因直接提取方法较为简便，故最终采用甲醇为供试品提取溶剂。

3.2流动相的选择

采用HPLC法测定中药复方制剂中的葛根素，流动相系统的选择有不同组成[4-7]，为了得到较好的色谱图和适宜的保留时间，本试验曾比较不同流动相分离的效果，如甲醇∶乙腈∶水(10∶10∶80)1 mg/mL枸橼酸-甲醇(75∶25)(22∶78)(24∶76)，均未能与杂质峰达到基线分离，而当选择甲醇-水(25∶75)作为流动相系统时，葛根素在11 min～13 min之间出峰，并与杂质峰能达到基线分离，分离效果好，保留时间适中，故选其作为流动相。

A.宫衣净酊阴性样品;B.葛根素标准品;C.宫衣净酊供试品

A.The negative sample of Gong-Yi-Jing tincture;B.The standard sample of puerarin;C.The sample of Gong-Yi-Jing tincture

图2宫衣净酊中葛根素的HPLC色谱图

Fig.2HPLC chromatogram of puerarin in Gong-Yi-Jing tincture

参考文献:

[1]谢家声，杨锐乐，李世宏，等．宫衣净酊剂及宫衣净 Ⅱ 号合剂防治奶牛胎衣不下效果观察[J]．中兽医学杂志，2008(S)：47-49．

[2]中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典[M]．北京：中国农业出版社，2010：453．

[3]肖学凤，高岚．HPLC法测定不同产地葛根中葛根素的含量[J]．中草药，2001，32(3)：220-220．

[4]李汶，黄诺嘉．高效液相色谱法测定芩连葛根片中葛根素的含量[J]．中国药事，1997， 11(3)：186-187．

[5]赵晓莉，崔小兵，狄留庆．HPLC法测定葛根素葡萄糖注射液中葛根素及3′-甲氧基葛根素含量[J]．中国中药杂志，2000，25(7)：413-415．

[6]陈立明，鞠瑞芬，熊付良，等．HPLC法测定黄芪降糖胶囊中葛根素的含量[J]．中成药，1999，21(10)：505-506．

[7]刘舒平，温国庆．HPLC法测定葛根炮制品中葛根素的含量[J]．中国中药杂志，1998，23(12)：723-725．

文献综述

Determination of Puerarin Content in Gong-Yi-Jing Tincture by HPLC

ZHU Yong-gang，CUI Dong-an，WANG Lei，WANG Xu-rong，ZHANG Jing-yan，LIN Jie，YANG Zhi-qiang，LI Jian-xi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

Abstract:In order to establish an HPLC method for the determination of puerarin in Gong-Yi-Jing tincture,the Agilent Eclipse XDB-C(18) column(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase of methanol to water (25∶75),flow rate of 1 mL/min were used.The column temperature is 30℃.The results showed that,in this chromatographic conditions,the liner range of puerarin was 18.25-584.00μg/mL(r=0.999 9,n=6).The average recovery rate was 108.83%(r=1.76%, n=6).The system precision is 1.025%.The results illustrated that the HPLC method is simple,accurate,repeatable and can be used for quality control of Gong-Yi-Jing tincture.

Key words:HPLC;Gong-Yi-Jing tincture;puerarin;content determination

文章编号:1007-5038(2016)04-0074-03

中图分类号:S853.74

文献标识码:A

作者简介：朱永刚(1991-)，男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事奶牛中兽药研发工作。*通讯作者

基金项目：公益性行业(农业)科研专项项目(201303040)

收稿日期：2015-10-02