肝癌组织中miRNA-200b表达及其与患者生存时间的关系

崔静，于泳，刘超，周英发，郑鹏远( 郑州大学第二附属医院，郑州45004； 郑州大学第五附属医院)



肝癌组织中miRNA-200b表达及其与患者生存时间的关系

崔静1，于泳1，刘超1，周英发1，郑鹏远2(1 郑州大学第二附属医院，郑州450014；2 郑州大学第五附属医院)

摘要：目的探讨miRNA-200b(miR-200b)在肝癌组织中的表达及其与患者生存时间的关系。方法选择行手术治疗的原发性肝癌患者76例，术中留取肝癌组织以及癌旁正常组织，采用RT-PCR技术检测miR-200b表达，分析其表达与患者临床病理特征的关系。以miR-200b相对表达量的中位数为界值，将患者分为miR-200b高表达和低表达，采用Kaplan-Meier生存分析法比较其生存情况。结果肝癌组织中miR-200b相对表达量为0.61±0.12，癌旁正常组织为1.37±0.19，二者比较P<0.05。miR-200b表达与肝癌患者淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、肝炎史和AFP均无关(P均>0.05)。miR-200b相对表达量中位数为0.597，76例患者中miR-200b高表达32例、低表达39例。随访2～60个月，miR-200b高表达者生存22例(68.7%)、中位生存期47.5个月，低表达者生存16例(41.0%)、中位生存期31.0个月；miR-200b高表达者生存率及生存期均高于低表达者(P均<0.05)。结论miR-200b在肝癌组织中低表达，其低表达与肿瘤浸润、转移有关，可影响患者生存时间。

关键词：原发性肝癌；miRNA-200b；淋巴结转移；生存时间

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、易转移、病死率高等特点[1，2]。其发病机制目前尚未完全清楚，可能是多因素共同作用的结果。微小RNA(miRNA)是一种广泛参与机体多种生物学功能的非编码短小RNA，可调控细胞增殖、分化和凋亡，在肿瘤发生、发展中具有重要作用[3]。miRNA-200b(miR-200b)是miR-200家族的重要成员，通过调控上皮-间质间转化(EMT)，在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥抑癌基因功能[4，5]。近年来，miR-200b与恶性肿瘤的关系已成为临床研究的热点，特别是与原发性肝癌的关系[6]。2008年5月～2010年5月，我们检测了原发性肝癌组织及癌旁组织中miR-200b表达，并分析其表达与患者临床病理参数及预后的关系。现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料选取同期在郑州大学第二附属医院手术切除的原发性肝癌组织及癌旁(距肿瘤边缘>3 cm)正常组织标本各76份。患者男57例、女19例，年龄27～79(56.7±10.4)岁；有肝炎(乙肝或丙肝)病史44例。组织病理学检查明确诊断，组织类型均为肝细胞癌，TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期20例，有淋巴结转移49例。所有患者术前未接受放化疗。

1.2miR-200b表达检测术中留取肝组织标本，液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存。取肝癌及癌旁组织标本，研磨，采用TRIzol试剂盒提取组织中总RNA。所有操作严格按照说明书进行，并对获得的总RNA进行检测，取A260/A280>1.8的标本完成后续实验。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，用PCR试剂盒完成PCR检测。miR-200b引物序列：上游引物：5′-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3′，下游引物：5′-AUCAUUACCAGGCAGUAUAAAU-3′；GAPDH引物序列：上游引物：5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物：5′-CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，共38个循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。采用2-ΔΔCt法计算miR-200b相对表达量。

1.3随访随访截至2015年5月31日，随访时间2～60个月。采取门诊随访和电话随访相结合，Kaplan-Meier生存分析法计算患者的总生存期。以miR-200b相对表达量的中位数为界值，将患者分为miR-200b高表达(中位数以上)和低表达(中位数以下)，统计不同表达者总生存期。

2结果

2.1miR-200b在肝癌及癌旁组织中表达肝癌组织中miR-200b的相对表达量为0.61±0.12，癌旁正常组织为1.37±0.19，二者比较差异有统计学意义(t=31.173，P<0.05)。

2.2肝癌组织miR-200b相对表达量与患者临床病理特征的关系见表1。

表1　肝癌组织miR-200b相对表达量与患者

注：*指既往明确诊断为慢性乙肝或丙肝者。

2.3不同miR-200b表达与肝癌患者预后的关系miR-200b相对表达量中位数为0.597，32例为miR-200b高表达，39例为低表达。miR-200b高表达者至随访截至日期生存22例(68.7%)，中位生存期47.5个月；低表达者生存16例(41.0%)，中位生存期31.0个月。Log-rank检验显示，miR-200b高表达者生存期高于低表达者(χ2=12.067，P<0.05)。见插页Ⅱ图6。

3讨论

miR-200家族是miRNA的重要组成部分，可在多种肿瘤组织中异常表达。研究发现，miR-200家族能抑制肿瘤转移中的关键步骤——EMT转化过程，在肿瘤转移过程中扮演重要角色[7～10]。miR-200b为miR-200家族的重要成员，亦参与肿瘤细胞浸润、转移等多种生物学行为[11，12]；在胆管癌组织中miR-200b低表达，上调miR-200b表达可降低人胆管癌细胞的侵袭力，增加其凋亡[13]；在子宫内膜癌中miR-200b作为癌基因，可抑制抑癌基因的表达，促进肿瘤进展[14]。但目前关于miR-200b在原发性肝癌组织中的表达研究较少。

本研究显示，肝癌组织中miR-200b相对表达量低于癌旁正常组织，提示miR-200b低表达可能与肝癌发生、发展过程有关；肝癌组织中miR-200b相对表达与患者淋巴结转移有关，提示miR-200b表达下调可能参与肝癌的细胞侵袭及转移过程。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-200b高表达者中位生存期长于低表达者，表明miR-200b高表达可提高患者生存率，延长生存期，与杨西胜等[15]报道基本一致。已有研究证实，miR-200b参与肿瘤细胞迁移、侵袭调控过程[16]。结合本研究结果，推测miR-200b在肝癌发生中可能发挥抑癌基因作用，高表达miR-200b可能通过下调E-cadherin或直接抑制EMT而减少肿瘤细胞迁移、侵袭的发生。

综上所述，miR-200b在肝癌组织中低表达，其低表达与肿瘤浸润、转移有关，可影响患者生存时间。

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(收稿日期：2015-09-28)

中图分类号：R735.7

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)08-0047-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.018

通信作者：郑鹏远(E-mail： 1541421042@qq.com)