牡蛎中氨基酸的傅里叶变换近红外光谱法快速定量测定

于 颖, 宋金明, 俞立东, 孙 萱

(中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071)

牡蛎中氨基酸的傅里叶变换近红外光谱法快速定量测定

于 颖, 宋金明, 俞立东, 孙 萱

(中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071)

本文通过乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一阶求导(1stDerivative, Db1)和Norris平滑等傅里叶变换近红外光谱定量分析数学模型, 用交叉验证法确定了最优化建模参数, 构建了牡蛎中氨基酸的快速定量测定方法。结果表明, 牡蛎近红外光谱与氨基酸含量化学计量学拟合, 线性相关系数为0.9860, 交叉验证后线性相关系数为0.9794, 对牡蛎样品进行检测, 结果与传统的氨基酸分析仪的测试结果相比, 相对误差小于2.5%, 方法的精密度(RSD)小于1.0%, 本文建立的傅里叶变换近红外光谱法定量分析牡蛎中氨基酸具有快速、准确、操作简便等特点, 测定重复性优于氨基酸分析仪法。

氨基酸; 定量测定; 牡蛎; 傅里叶变换近红外光谱法

随着计算机技术和化学计量学的发展以及近红外光谱定量技术的进步, 傅里叶变换近红外光谱(FT-IR)分析技术越来越多地在许多领域被广泛使用,已经成为一种极具竞争力的光谱定量分析方法。化合物分子中C—H、N—H、O—H和C—O等基团基频振动的合频和倍频振动的吸收峰位于近红外光谱区, 因此近红外技术比较适于分析与这些基团有直接或间接关系的成分[1]。氨基酸分子具有上述基团,理论上采用近红外光谱法测定牡蛎中氨基酸含量是可行的, 氨基酸分子结构通式为:

牡蛎又名蚝、海蛎子、蛎黄、蛎蛤、牡蛤、古贲、蚵, 属软体动物门双壳纲珍珠贝目的曲蛎科和牡蛎科[2]。牡蛎是世界上最重要的养殖贝类和我国四大养殖贝类之一。牡蛎味道鲜美, 营养丰富, 可提高人体免疫力, 具有很高的药用价值, 牡蛎肉中必需氨基酸完全程度和质量比例优于人乳和牛乳[3-4]。氨基酸是牡蛎中的重要营养成分, 是评价牡蛎质量的重要指标, 因此也是牡蛎选苗育种的重要考虑因素[5], 氨基酸在碳的生物地球化学循环中具有重要价值, 定量获取氨基酸含量是揭示其生态学功能的前提[6-7]。其常规测定方法是用盐酸将样品水解, 经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后, 与茚三酮的溶液产生颜色反应, 再通过分光光度计比色测定氨基酸含量[8], 该方法样品前处理繁琐(水解、浓缩等)、成本高, 且非常费时(>36h), 不适用于大批量快速分析的要求。常规氨基酸测定方法测定的是不同种类氨基酸含量, 最终加和为氨基酸总量, 因一般评价牡蛎中营养价值考察的是总量, 不同种类氨基酸含量意义不明显,因此本文仅研究牡蛎中氨基酸总量的快速检测方法。近红外光谱法定量测定大豆等样品中氨基酸已有相关报道[9], 但至目前其用于牡蛎中氨基酸快速定量的研究和探索尚属空白。

本研究采用美国Thermo Fisher Scientific公司的Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪和相应的软件RESULT-Integration 和TQ Analyst定量分析软件, 对牡蛎进行近红外光谱扫描和分析, 建立了快速测定牡蛎中氨基酸含量的分析模型。结果表明, 方法不仅快速(<5min)可行, 重复性和再现性良好, 而且由于不需要繁琐的样品分析前处理, 基本没有试剂及耗材的消费。

1 实验部分

1.1 仪器与样品

美国Thermo Fisher Scientific公司的Antaris Ⅱ型号的傅里叶变换近红外光谱仪, 仪器采用CaF2分束器, 配备InGaAs检测器、漫反射积分球(内置背景)、透射模块、光纤模块等配件及相应的RESULTIntegration 和TQ Analyst 定量分析软件。

本次实验选择来自丹东、大连、昌黎、海洋岛、韩国、加拿大等不同地区的87组牡蛎样品作为建模与验证样品, 随机抽取其中10个用于建模后比对和验证实验, 另外77组作为建立数学模型的样品集。将样品水洗净后放置于组织捣碎机在10 000~15 000 r/min条件下研磨制成组织匀浆, 将匀浆转移到5mL样品管中后放入–20℃冷冻 10 h, 冷冻后的样品用冷冻干燥机干燥 20 h后用于测定。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎氨基酸定量结果基础数据的获取

根据国家标准方法准确称取牡蛎干粉20 mg左右(精确到0.001g)于安培瓶中, 加入10 mL6 mol/L盐酸, 充氮气后密封。置于110℃烘箱中水解24 h后减压蒸干, 用0.02mol/L盐酸定容至10 mL。量取制备好的样品200 µL, 置于1 mL离心管中, 加入100 µL三乙胺溶液、异硫氰酸苯酯100 µL, 混匀, 室温放置1 h, 然后加入400 mL正己烷振摇后放置10 min, 取下层溶液, 用0.45 µm膜过滤后, 用氨基酸分析仪检测, 通过外标法获得氨基酸含量。

1.2.2 光谱采集方法

将3~5 g牡蛎试样直接放置在积分球采集点上,利用RESULT-Integration软件设计信息采集工作流,设置采集参数为在4 000~10 000 cm–1范围内扫描32次, 分辨率8.0 cm–1, 优化增益无衰减, 以漫反射的方式采集光谱。每个样品分别测试3次, 取其平均光谱。

1.2.3 数学模型的建立与优化

采集所有样品的漫反射红外透射光谱图后, 在“Standards”界面添加建立模型使用的样品光谱, 导入建模样品的国标法测定值, 采用最小二乘法(PLS)作为建立数学模型的化学计量学方法, 利用TQ Analyst 定量分析软件进行数学预建模。根据预建模的关联结果, 利用马氏距离的方法诊断光谱中异常值, 采用乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一阶求导(1st Derivative, Db1)、Norris平滑(其中segment lengths 选择5, gap between segment选择5)等方法对光谱进行预处理, 得到关联系数较高的数据模型(图1)。

1.2.4 数据模型的验证

对模型进行交叉验证, 即每次从建模样品集中取出一个样品, 用剩下的(N–1)个样品建立模型, 预测被取出的样品, 如此循环直至所有样品均被预测一次。考察预测值与国标法测定值的相关系数(R)和均方差(RMSECV)。

利用建立完成化学计量学数学模型, 并随机抽取的俩个样品分别进行10次重复性实验。利用该模型检测随机抽取的十个样品, 结果与氨基酸国标法比对。

表征近红外光谱定量模型建模效果的指标有校正相关系数RC、交叉验证相关系数RCV, 校正集误差均方根RMSRC、交叉验证误差均方根RMSSECV, 各参数的计算方程式如下:

式中, Ci为真实值或标准方法测定得到的参考值,是模拟拟合值,是交叉验证时的模型拟合值, Cˆ是参考值的平均值, n是校正集样品数。

图1 数据模型Fig. 1 Model data

2 结果与分析

2.1 牡蛎的近红外光谱图和光谱范围的选择

用近红外光谱仪扫描出87个牡蛎试样的近红外光谱图(图2)。利用马氏距离法鉴别光谱异常值(图3), 其中显示分布图中的一个样品为异常, 将该样品光谱值在数学模型中剔除, 用主成分分析佐证其他样品光谱图无异常(图4)。如图2所示, 牡蛎红外吸收峰主要集中在4 000~7 500 cm–1范围, 其中在5 257 cm–1、4 900 cm–1和4 537 cm–1处分别为氨基酸基团O-H、N-H、C-H等倍频吸收峰, 求导后信号峰更明显见图5和图6, 包含氨基酸含量的重要信息。根据光谱原始图(图2)和导数图(图3和图4)中吸收峰的位置, 将考查光谱范围分为4 000~10 000 cm–1、 4 000~9 000 cm–1、4 000~7 500 cm–1、4 000~6 250 cm–1,逐步剔除不提供信息的变量, 根据不同波段的谱图与氨基酸含量的相关性进行光谱范围的筛选。实验结果(表1)表明代表牡蛎中氨基酸含量变化红外吸收峰主要集中在4 000~7 500cm–1, 虽然氨基酸基团- CONH近红外吸收峰在6 250~7 500cm–1之间, 但由二阶导谱图分离可以看出该波段属于不同化学物质的合峰, 且响应较弱, 因此将光谱范围锁定在4 000~6 250 cm–1, 通过微调, 最终确定最佳光谱范围在4 043~6 212 cm–1。

图2 牡蛎原始近红外光谱图Fig. 2 NIR spectrum of oyster

图3 马氏距离方法鉴别异常值Fig. 3 Identification of outliers using Markov distance method

表1 模型的光谱范围筛选实验结果Tab. 1 Experimental results of spectral range screening

2.2 光谱预处理

近红外光谱不仅可以反映样品的化学组成及含量等信息, 还会受到其密度、粒度等物理因素的干扰,甚至还包含有一部分的无关信息, 如背景噪声、杂散光等。为了尽可能多地从光谱中提取与待测化学组分相关的信息, 以便建立稳定可靠的定性、定量预测模型, 就必须对光谱进行适当地预处理, 消除其他无关信息的干扰[10-11]。一般近红外光谱建立化学计量学数据模型, 都通过一定预处理方法提高光谱与数值间的拟合度, 因此本实验考察了乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一阶导数(1stDerivative, Db1)、二阶导数(2ndDerivative, Db2)等常用光谱预处理方法对数学模型的线性相关系数的影响(表2)。

图4 主成分分析3D立体图Fig. 4 Principal component analysis 3D stereo diagram

图5 一阶导数(1stDerivative, Db1)近红外光谱图Fig. 5 First order derivative (Derivative, Db1) NIR spectroscopy

图6 二阶导数(2ndDerivative, Db2)近红外光谱图Fig. 6 Second order derivative (Derivative, Db1) NIR spectroscopy

实验结果表明, 导数可以用于消除光谱的基线漂移及背景干扰, 分辨重叠峰, 提高分辨率和灵敏度, 但求导过程中同时也会放大噪声信号。一阶导数(Db1)已经将信号明显放大, 虽然二阶导数(Db2)放大信号作用比一阶导数要好, 但是同时放大了波数小于4 500 cm–1等处的噪声, 信噪比和相关系数相对反而降低。因此选择一阶导数Db1。通过表2可以看出, 虽然通过光谱预处理法提高了线性关系, 但是提高结果并不显著, 主要原因是本实验牡蛎吸收峰95%以上是氨基酸分子特征峰, 谱图噪声少, 在选定的光谱范围内几乎无无关信息, 因此在没有光谱预处理的情况下也可以得到很好的线性关系, 同时也说明该数据模型很好的代表了牡蛎中氨基酸含量变化, 说明了近红外检测氨基酸含量方法是可行的。本实验最终采用了乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、导数( Derivative)、Norris平滑(其中segment lengths 选择5, gap between segment选择5)等方法对光谱进行预处理。

表2 不同预处理方法的数学模型结果Tab. 2 Mathematical model correlation coefficient of different pretreatment methods

表3 近红外-氨基酸含量数学模型的效果Tab. 3 Effect of mathematical model of near infrared amino acid content

2.3 交叉验证的结果

利用化学计量学方法最小二乘法(PLS)将牡蛎的近红外光谱与氨基酸含量进行拟合, 通过交叉验证优化参数, 建模样品的模型预测值与国标法测氨基酸真值相关系数为0.9860, 误差均方根(RMSEC)为0.379, 交叉验证相关系数为0.9794, 交叉验证误差均方根(RMSECV)为0.460。预测值与真值绝对误差小于±1%。结果表明, 数学模型良好, 预测准确度高。

表4 近红外法与氨基酸分析仪法比对实验结果Tab. 4 Comparison of results of NIR with amino acid analyzer

表5 近红外光谱法重复性实验Tab. 5 Results of repeated experiments in NIR

2.4 方法比对实验和重复性实验

随机抽取10个待测样品, 分别采用新建近红外光谱法和氨基酸分析仪检测, 检测结果(表4)的最大相对偏差小于±1%, 相对误差小于2.5%。采用新建的近红外光谱法对两个样品分别进行10次测定, 结果(表5)表明, 该方法测定牡蛎中氨基酸重复性很好,重复性测定结果的RSD小于1%。因氨基酸分析仪法前处理复杂, 而近红外法测定氨基酸含量不需要进行任何前处理, 从而降低了误差来源, 因此近红外法重复性优于氨基酸分析仪法。

表6 氨基酸分析仪重复性实验Tab. 6 Results of repeated experiments in amino acid analyzer

3 结论

本研究表明, 在4 000~7 500 cm–1光谱范围内,牡蛎近红外谱图含有氨基酸分子主要基团O-H、N-H、C-H等的近红外倍频吸收峰, 且无其他无关信息峰, 光谱噪声小, 信息峰强度高, 因此构建近红外法氨基酸含量测定模型是可以实现的。本文利用化学计量学最小二乘法(PLS)将牡蛎近红外光谱与氨基酸含量进行拟合, 采用乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一阶求导(1st Derivative, Db1)、Norris平滑等光谱预处理方法优化数学模型,建立了傅里叶变换近红外光谱定量分析牡蛎中氨基酸的数学模型, 通过对模型进行交叉实验验证, 近红外法的测定值与氨基酸真值之间的线性相关系数为0.986 0, 与氨基酸分析仪检测氨基酸含量对比绝对误差小于±1%, 相对误差小于2.5%, 实验结果表明建立的数学模型预测的准确度高。对于相同的样品, 氨基酸含量的近红外光谱法无需样品前处理,降低了误差的来源, 实验重复性高于氨基酸分析仪。本文发展的傅里叶近红外光谱法为快速评价牡蛎中的氨基酸营养成分提供了可行的方法。

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Received:Feb. 11, 2016

Quantitative analysis of amino acids in oyster by FT-NIR spectroscopy

YU Ying, SONG Jin-ming, YU Li-dong, SUN Xuan
(Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

amino acids; Quantitative determination; oyster; Fourier transform-near infrared spectroscopy (FT-NIR)

In this study, spectra pretreatment methods of multiplicative scattering correction (MSC), Norris smoothing, and 1st Derivative (Db1) were applied to develop a FT-NIR mathematics model for quantitative analysis of amino acids in oyster. Optimum parameters of the model were studied using a cross validation method. By fitting the total amino content to the spectra, the linear correlation coefficient was found to be 0.9860 and the linear correlation coefficient of cross validation was 0.9794. The develop method was used to determine amino acids in oyster and results show no obvious difference between using the developed NIR and the traditional amino acid analyzer, with a relative error of less than 1.0% and repeatability of 1.0% RSD(n = 10). This suggests that the new NIR method is feasible for high precision determining of amino acids in oyster.

Q517

A

1000-3096(2016)12-0001-07

10.11759/hykx20160331005

(本文编辑: 梁德海)

2016-02-11;

2016-05-22

中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目(yg2012055)

[Foundation: Technology Innovation Project of the Instrument and Equipment of the CAS, No. yg2015055]

于颖(1973-), 女, 辽宁鞍山人, 硕士, 高级工程师, 主要近红外和中红外分析研究, 电话: 0532-82898876, E-mail: yingyu@qido.ac.cn;宋金明, 通信作者, 研究员, 博士生导师. E-mail: jmsong@qdio.ac.cn