许氏平鲉微卫星标记与体长、体质量、体高的相关性分析

2016-04-10 01:51韩承慧马海涛姜海滨
海洋科学 2016年12期
关键词:许氏微卫星体长

韩承慧, 马海涛 薛 蕊, 姜海滨 常 城, 王 腾

(1. 山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 3. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071)

许氏平鲉微卫星标记与体长、体质量、体高的相关性分析

韩承慧1,2, 马海涛1, 薛 蕊3, 姜海滨1, 常 城1,2, 王 腾1,2

(1. 山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 3. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071)

为了解许氏平鲉(Sebastes schlegelii)微卫星标记与生长性状的相关性, 选取26个微卫星标记在海捕许氏平鲉群体中进行微卫星筛选, 每个微卫星位点的等位基因数(Na)在3~21, 有效等位基因数(Ne)为1.1815~15.5676; 观测杂合度(Ho)范围为0.0417~0.9999; 期望杂合度(He)范围为0.1581~0.9456;多态信息含量(PIC)范围为0.1509~0.9320。利用单标记分析法分析了多态性较高(PIC>0.5)的22个标记与体长、体质量、体高的相关性, 结果显示3个标记与生长性状显著相关, 其中HJ2-32与体长、体质量和体高显著相关(P<0.05), 并推断等位基因D与C对于体质量、体长、体高分别具有重要的正向与负向影响; HJ7-2与体质量显著相关; HJ7-22与体长显著相关, 并推测等位基因F对体长具有正向影响,等位基因B对体长有负面影响。这些标记可为许氏平鲉分子标记辅助育种提供基础。

许氏平鲉(Sebastes schlegelii); 微卫星标记; 生长性状; 相关性分析

许氏平鲉(Sebastes schlegelii), 俗称黑鲪, 属鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉亚目(Scorpaenoidei)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉亚科(Sebastinae)、平鲉属(Sebastodes)[1], 广泛分布于中国东海、黄海和渤海,属于卵胎生种类[2], 雌鱼的性成熟时间一般为3 a,雄鱼则一般为4 a。目前养殖苗种以海捕野生苗为主要来源, 养殖成活率较低, 长期的过度捕捞也使许氏平鲉资源和遗传多样性遭到破坏, 因此进行其良种选育已成为保护中国许氏平鲉资源、促进许氏平鲉养殖业可持续发展的必要手段[3]。

鱼类的体长、体质量和体高均属于数量性状, 由于基因连锁、一效多因等的存在, 导致数量性状受多基因控制, 遗传基础复杂。随着分子遗传标记的飞速发展, 人们将控制数量性状的多个基因分开研究,理论上任何一个表型性状的基因都存在与之连锁的DNA标记[4]。此种方法为优良品种的快速培育提供了可靠和有效的工具, 利用分子标记辅助选择(MAS), 可找到与数量性状位点相连锁的分子遗传标记, 实现缩短时代间隔早期选种及提高选种准确性, 并加快新品种的培育。微卫星分子标记, 作为第二代分子标记手段, 具有多态性高、方便快捷、稳定性高等特点[5], 已经被广泛应用于水产动物分子标记与数量性状的相关性分析和QTL定位之中[6]。国内外对于许氏平鲉微卫星标记的研究尚处于起步阶段, 日本学者Yoshida等[7]首先利用两重PCR扩增的方法获得6个微卫星标记; 韩国学者An等[8]利用磁珠富集法获得了14个微卫星标记; Yasuike等[9]利用454测序法筛选了17个微卫星标记。国内方面, Bai等[10]运用磁珠富集的方法获得了18个微卫星标记;初冠囡等[11]发表了17个许氏平鲉微卫星标记; 贾超峰等[12]报道了15个具有多态性的微卫星标记,薛蕊等[13]开发EST-SSR标记18个。由于微卫星标记的开发数量较少, 目前许氏平鲉微卫星标记主要应用于群体遗传多样性分析及家系鉴定[6,11]。本研究以26个微卫星标记为基础, 分析许氏平鲉微卫星标记与其经济性状(其体长、体质量、体高)的相关性, 为许氏平鲉数量性状定位和进一步分子标记育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所需材料为2009年山东胶南海捕许氏平鲉, 规格为4 cm~5 cm, 暂养于山东泰华海洋科技有限公司(国家级许氏平鲉原种场), 2011年随机挑选48尾, 分别标号1~48, 测量其体质量、体长、体高3组数据。剪取部分尾鳍于70%酒精中, 带回实验室–20℃保存, 并尽快提取基因组DNA。

1.2 数量性状测量

由于许氏平鲉个体较大, 生性凶猛, 因此先使用MS-222对所测量鱼类麻醉[14], 质量浓度为30 mg/L的MS-222麻醉15 min。体长、体高分度值为0.1 cm, 体质量分度值为0.1 g。

1.3 基因组DNA的提取

取尾鳍样品约30 mg, 采用传统酚/氯仿/异戊醇抽提法提取基因组DNA[15]。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性, NanoDrop2000检测DNA的浓度和纯度。–20℃保存, 使用前稀释至50 ng/μL。

1.4 微卫星引物的设计及筛选

本实验所用微卫星标记来自贾超峰等发表的高度多态的微卫星标记14个(HJ1-6至HJ4-94)[12], 通过高通量测序法开发其微卫星标记11个(HJ6-19至HJ8-65), 并从Yoshida[7]报道中选取1个(SSC12)。引物由上海生工生物有限公司合成, TE稀释。微卫星引物特征参见表1。

1.5 微卫星PCR扩增及检测

采用总体积为25 μL的反应体系, 包括2 μL DNA模板(50 ng /μL), 2.5 μL 10×buffer, 引物各1 μL (50 μmol/L), 0.5 μL dNTPs(10 mmol/L), 0.2 μLTaq DNA聚合酶(5U/μL), 灭菌水补足。PCR反应程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性40 s, 退火反应40 s(退火温度见表1), 72℃延伸1 min, 30个循环; 最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物通过10%(W/V)非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及0.1%硝酸银染色, 扫描检测其多态性。

表1 26对许氏平鲉微卫星引物的特征Tab. 1 Characteristics of 26 pairs of microsatellite primers for Sebastes schlegelii

续表

1.6 数据统计与分析

将电泳条带中的每个DNA片段作为一个等位基因, 统计每个微卫星标记的基因型, 根据迁移率的不同从大到小依次定义为A、B、C……Z。Genepop卡方检验估计群体的Hard-Weinberg平衡, Bonferroni校正; Popgene软件统计各微卫星位点的等位基因数((Na))、有效等位基因数((Ne))、观测杂合度(Ho), 期望杂合度(He), PIC Calc 0.6计算每个位点的多态信息含量(PIC); SPSS19.0检验许氏平鲉的体长、体质量、体高3个性状数据的正态性并分析3个性状之间的相关性; 一般线性模型(GLM)进行标记与性状的相关性分析, 模型为y=u+gi+e, 其中y为性状观测值, u为群体均值, g为第i个个体的基因型效应, e为随机误差, 因为测量时间为9月份, 性腺未发育,不考虑性别效应; 对不同标记基因型之间的性状差异性检测并进行LSD多重比较。

2 结果

2.1 微卫星位点的筛选

所有微卫星引物在群体中均表现出了较高的多态性(表2)。26个微卫星标记在48个许氏平鲉个体中共得到260个等位基因, 每个微卫星位点的等位基因数(Na)在3~21, 平均等位基因数为10.0000, 有效等位基因数(Ne)为1.1815~15.5676, 平均值为6.1631; 观测杂合度(Ho)范围为0.0417~0.9999, 平均值为0.6290; 期望杂合度(He)范围为0.1581~0.9456,平均值为0.7253; 多态信息含量(PIC)范围为0.1509~ 0.9320, 平均值为0.6919。其中HJ4-47, HJ4-64, HJ7-38和HJ8-25为中低度多态(PIC<0.5), 其余22个位点均表现为高度多态性, Weber[16]认为只有在微卫星标记表现出较高的PIC值, 才可以进行的相应的多态性分析, 因此, 本研究选用高度多态的22个微卫星位点分析与性状的相关性。各个微卫星位点的Hardy-Weinberg平衡检测结果发现有11个微卫星位点显著偏离平衡, 占总数的42.3%。研究表明在海洋经济鱼类、贝类、棘皮类的群体中被检测位点偏离Hardy-Weinberg平衡的现象普遍存在[17]。

2.2 生长性状之间的相关性

K-S检验许氏平鲉体长、体高、体质量3个性状数据, 3个性状的双侧渐进显著性取值均大于0.10, 说明此3个性状均服从正态分布。Pearson检验两性状之间的相关性, 结果见表3。研究表明3个表型值在群体中表现出较高的相关性, 体长与体高的相关系数>体长与体质量的相关系数>体高与体质量的相关系数。以体质量做因变量, 体长和体高作自变量的通径分析结果: 体高对体质量的通径系数为0.620, 体长对体质量的通径系数为0.358, 说明体高对体质量的直接作用大于体长对体质量的直接作用。

表2 48尾许氏平鲉个体中26个微卫星标记的遗传参数Tab. 2 Genetic diversity parameters of 26 microsatellite primers for Sebastes schlegelii individuals

2.3 微卫星标记与生长性状之间的相关性分析

利用SPSS中的一般线性模型对22个中高度多态性(P>0.5)微卫星标记和48个许氏平鲉个体的体长、体质量、体高进行相关性分析。由于一些位点中基因型的出现频率较少, 缺少分析价值, 因此统计时相同基因型个体至少出现4次才做分析[4]。HJ1-6, HJ2-28, HJ3-23, HJ4-92, HJ7-68, HJ7-93, SSC12的等位基因数较多, 均未出现个体数不少于4个的基因型, 不进行相关性分析。其余15个微卫星标记的不同基因型个体的生长性状平均值如表4所示。其中HJ2-32与体长、体质量和体高具有显著相关(P<0.05), HJ7-2与体质量显著相关, HJ7-22与体长显著相关。

表3 两性状之间的相关性系数Tab. 3 Correlation coefficients between two traits

表4 15个微卫星位点不同基因型个体体长、体质量和体高平均值和多重比较Tab. 4 Mean values and multiple comparisons of body length, weight, and height in 15 microsatellite loci

续表

在微卫星位点HJ2-32中共检测到7个基因型,基因型DD的观测值少于4个不作分析, 其中基因型CD个体的体质量、体长、体高均高于其他基因型的个体, 且显著高于基因型CC个体, 因此可以推断等位基因D对于体质量、体长、体高具有重要的正向影响; 基因型CC个体的体质量、体长、体高均低于其他基因型个体, 且显著低于基因型BD、CD的个体(P<0.05), 因此推断等位基因C对体质量、体长和体高有负面影响。

在微卫星位点HJ7-2中, 基因型KK的个体体质量观测值显著大于其他个体, 基因型NN的观测值均小于其他基因型的观测值, 除基因型KK的个体无显著差异。

在微卫星位点HJ7-22中, 基因型BB个体体长的观测值显著小于其他基因型的观测值, 含有等位基因F的基因型BF、CF的个体体长观测值大于其他基因型的个体, 推测等位基因F对体长具有正向影响, 等位基因B对体长有负面影响。

3 讨论

许氏平鲉肉质鲜美, 营养丰富, 经济价值高, 是中国北方海水网箱养殖的主要对象之一, 但其生长速度较为缓慢, 达到市场规格(500 g)需要2~3 a, 因此开展许氏平鲉生长性状相关的微卫星标记筛选研究, 对选育优质快速生长新品系, 减少成鱼养殖成本, 提高资源利用率有重要意义。

单标记相关性分析利用一个遗传标记与一个假定的QTL进行连锁分析, 根据分离群体中标记基因型间的数量性状平均值的差异来分析确定该标记所在区域是否存在QTL[18], 通常使用的分析方法是方差分析、回归分析或似然比检验, 如不同基因型数量性状均值存在显著差异, 则说明控制该数量性状的QTL与标记有连锁。微卫星标记是水产动物遗传研究应用中最广泛的标记, 目前国内外对于许氏平鲉微卫星标记的开发还处于起步阶段, 未发表高密度的遗传连锁图谱。单标记分析法是在缺乏高密度遗传连锁图谱物种中进行数量性状分析的简单有效方法, 是目前水产动物遗传标记应用于分子标记辅助育种的有效途径, 已得到广泛应用, 如大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选[19], 尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)微卫星标记与主要生长性状的相关性分析[20], 鲫(Carassius auratus)微卫星标记与几个生长性状的相关性分析[21]。但是此种方法存在不能确定QTL的可靠位置, 不能计算QTL效应和重组率等弊端。

本研究中所用样本为野生海捕的48个许氏平鲉个体, 有6个微卫星标记中出现相同基因型个体均少于4个的现象, 这可能与微卫星标记的多态性较高,等位基因数多, 但群体个体数不足有关。闵霞等[22]在微卫星分子标记与松浦镜鲤(Cyprinus carpio Songpu carp)3个表型性状的相关分析中选取了194个松浦镜鲤个体; 崔晓亮等[23]在鲫(Carassius auratus)体长和体高相关的EST-SSR标记的筛选研究中选用了不同家系的181个个体; 张义凤等[24]在鲤鱼(Cyprinus carpio)微卫星标记与体质量、体长和体高性状的相关性分析中选用了92个个体。因此获得更加精确性的性状相关的微卫星标记需要增加的分析样本数量。

水产动物的选育过程中, 确定并合理利用物种性状间的相关性至关重要, 可以有效地提高选育效果。只有在相关系数R大于或等于0.85时, 才能作为通径分析的自变量[25]。本研究中, 体长、体高与体质量的相关系数分别为0.907、0.937, 因此可作为对体质量通径分析的自变量, 结果发现体高对体质量的直接作用大于体长对体质量的直接作用, 可作为选育工作的指导。

本研究筛选得出与体长、体质量、体高均相关的微卫星标记HJ2-32, 群体的平均体长、平均体质量、平均体高分别为35.5 cm、639.2 g、9.3 cm, 基因型CD对3种表型性状均表现出正向相关, 其个体的平均值分别为: 38.1 cm、741.2 g和9.8 cm, 比群体平均值分别高出7.3%、16.0%、5.4%; 标记HJ7-2基因型KK的个体体质量平均值为756.8 g, 高出群体平均值18.4%, 基因型NN的个体平均值为477.2 g,低于平均值25.4%; 标记HJ7-22中基因型为BB个体的体长平均值比群体平均值低11.2%, 含有等位基因F的个体平均值比群体平均值高5.9%。因此HJ2-32, HJ7-2, HJ7-22 3个标记可以应用于增进优势性状, 避免劣势性状的分子育种中, 使传统育种与分子育种相结合, 加快育种的进程。随着分子标记的快速发展, 许氏平鲉微卫星标记数量的增加, 更多与经济性状相关的分子标记的获得, 以及高密度遗传连锁图谱的构建, 可以加快遗传育种的进程, 从而培育出抗逆速生的许氏平鲉新品系。

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Received:Oct. 30, 2015

Correlation analysis of microsatellite markers with body length, weight, and height in Sebastes schlegelii

HAN Cheng-hui1,2, MA Hai-tao1, XUE Rui3, JIANG Hai-bin1, CHANG Cheng1,2, WANG Teng1,2
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Sebastes schlegelii; microsatellite; growth traits; correlation analysis

Twenty-six polymorphic microsatellite markers were selected to estimate a wild population of Sebastes schlegelii for studying the correlation between microsatellite markers and growth traits, which revealed that the number of alleles was 260 and the allele numbers ranged from 3 to 21 per locus. The observed and expected heterozygosity varied from 0.0417 to 0.9999 and from 0.1581 to 0.9456, respectively. The values of polymorphic information content ranged from 0.1509 to 0.9320. Twenty-two microsatellite loci with high polymorphism were used to analyze the correlation with body length, weight, and height by single marker-based analysis. The results showed that these markers significantly correlated with growth traits; loci HJ2-32 significantly correlated with three growth traits, and alleles D and C had positive and negative effects on growth traits, respectively. HJ7-2 showed a significant correlation with body weight; alleles F and B of HJ7-22 had positive and negative effects on length traits, respectively. These aforementioned markers would be of benefit for a further study on molecular marker-assisted breeding of S. schlegelii.

S965

A

1000-3096(2016)12-0047-09

10.11759//hykx20151030002

(本文编辑: 谭雪静)

2015-10-30;

2015-12-23

山东省良种工程项目(2014-2017)

[Foundation: Shandong Province Breeding Project No.2014-2017]

韩承慧(1990-), 男, 山东莱芜人, 硕士研究生, 主要从事水产养殖工作, 电话: 15564507213, E-mail: CH_Han1990@163.com;姜海滨, 通信作者, 研究员, E-mail: haibinjiang326@163.com

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