狼毒药材HPLC指纹图谱研究

邓德红,胡　菊

(1.湖北省孝感麻风防治中心,湖北汉川 431600；2.湖北工业职业技术学院环境工程系，湖北十堰 442000)



·论著·

狼毒药材HPLC指纹图谱研究

邓德红1,胡菊2△

(1.湖北省孝感麻风防治中心,湖北汉川 431600；2.湖北工业职业技术学院环境工程系，湖北十堰 442000)

摘要:目的采用高效液相色谱法(HPLC)建立狼毒药材的指纹图谱。方法2013年10月至2014年10月，使用Hypersil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min，柱温20 ℃，检测波长210 nm，进样20 μL。结果对不同来源15批狼毒药材进行了分析，标定了15个共有峰，15个共有峰相对保留时间相对标准差(RSD)≤3.7%，相对峰面积 RSD≤3.6%；各色谱峰分离度较好，相似度较高，15批不同来源狼毒药材中，除了广西南宁药材料相似度为0.858，其他产地药材料相似度均在0.95以上。达到了中药指纹图谱的技术要求。结论该方法简便、准确、重现性好，可用于狼毒指纹图谱的测定及质量控制。

关键词:狼毒；高效液相；指纹图谱；质量控制

狼毒为瑞香科植物瑞香狼毒或大戟科植物狼毒大戟、月腺大戟的根，有毒。中医学上用其根祛痰、止痛、消积、杀虫[1]。狼毒主要含有二萜、黄酮、木质素、香豆精类成分；其中二萜类主要包括格尼迪木任、河朔荛花素、赭雷毒素等；黄酮类主要包括狼毒素A、狼毒素B、狼毒素C、异狼毒素、7-甲氧基狼毒素、新狼毒素等[2-3]。现代药理学研究表明，其提取物具有良好的抗肿瘤、抗病毒、杀菌、抗癫痫和免疫调节作用[4-6]。因此，近年来，加快了狼毒的化学成分与质量标准研究。本文对不同来源15批狼毒药材进行了分析，从而建立了狼毒药材的指纹图谱，为狼毒的体内外研究和临床应用等提供了依据。

1材料与方法

1.1标本来源2013年10月至2014年10月，狼毒素A购于中国药物检定研究院,异狼毒素B为实验室自制(面积归一化法，其纯度为98.2%)。乙醇(AR，北京化学试剂厂)，乙腈(色谱纯，欧普森)。15批不同来源狼毒药材经鉴定为瑞香科植物瑞香狼毒的干燥根。

1.2仪器与试剂2695高效液相色谱仪(美国Waters 公司)，超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多有限公司)；中药粉碎机(瑞安市百信药机器械厂)，鼓风干燥箱(广州泰思科学仪器有限公司)。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的制备精密称取狼毒素A和异狼毒素B适量，置10 mL的容量瓶中，加乙腈-水定容至10 mL。制成质量浓度分别为30.15、12.96 mg/L混合对照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏备用[7-9]。

1.3.2供试品溶液的制备将狼毒药材打成粉，过40目筛。称取狼毒药材粉末2.5 g，加甲醇-水25 mL，称重，超声处理35 min，放冷，加甲醇补足重量。过0.45 μm 微孔滤膜，即得狼毒药材供试品[10]。

1.3.3测定方法按上述对照品与供试品制备方法制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品和供试品溶液各20 μL[7]。采用 HPLC 法对15 批狼毒药材进行指纹图谱构建，以狼毒素A和异狼毒素B的峰面积和保留时间为参考，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

1.4方法学考察

1.4.1精密度试验称取狼毒药材适量，按供试品溶液的方法制备，照上述方法测定，且重复进样6次，检测各共有峰的相对保留时间。

1.4.2稳定性试验取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样分析。

1.4.3重复性试验称取狼毒药材适量，按上述供试品溶液制备方法制备6 份样品，按照测定方法进行检测。

1.5色谱条件Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相乙腈(A)-水(B) 洗脱梯度(0～5 min，20%～30% A；5～10 min，30%～45% A；10～30 min，45%～55% A；30～70 min，55%～60% A；70～80 min，60%～65% A；80～100 min，65%～70% A)，流速为1.0(mL/min)，检测波长210 nm，柱温20 ℃，进样量20 μL[8]。

2结果

2.1指纹图谱分析对15批不同来源的狼毒药材HPLC指纹图谱检测结果进行相似度评价，见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。标定了分离度较高的15个峰作为共有峰。其中狼毒素A和异狼毒素B出峰位适中，且分离效果好，无前沿和拖尾，因此选定其为参照峰，并计算各峰的相对峰面积,见表1。

表1　　狼毒药材指纹图谱15个共有峰相对峰面积值

2.2相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)》软件[11]，导入15批样品色谱图，结果表明，15批不同来源狼毒药材中，除了广西南宁药材料相似度为0.858，其他产地药材料相似度均在0.95以上。

表2　　不同来源狼毒药材相似度计算结果

3讨论

瑞香狼毒属于瑞香科植物的干燥根，也称为断肠草，其性平、味苦、辛，有毒，可入肺脾肝经，具有坡积杀虫、逐水祛痰的作用。狼毒通常广泛分布于我国黑龙江、内蒙古、西北等地，并在西北地区销售、应用。现阶段，国内外诸多学者对狼毒的化学成分进行了深入的探究，从中发现了许多二萜类、香豆素类、黄酮类等成分均存在较强的抗病毒、抗肿瘤等作用，尤其是抗人类免疫缺陷病毒的作用。部颁标准对狼毒药材的质量控制局限于理化鉴别，无法完整、系统的体现狼毒的内在质量。近些年来，指纹图谱已经成为国际统一公认的控制中药、天然药物质量最有效的手段。为了更有效地控制狼毒中药材，或是含有狼毒的中药复方剂的质量，本次试验采用HPLC建立狼毒药材的指纹图谱，结果发现不同来源15批狼毒药材，标定了15个共有峰，15个共有峰相对保留时间 RSD≤3.7%，相对峰面积 RSD≤3.6%；各色谱峰分离度较好，相似度较高，15批不同来源狼毒药材中，除了广西南宁药材料相似度为0.858，其他产地药材料相似度均在0.95以上。达到了中药指纹图谱的技术要求。

本研究考察了不同的提取溶媒和提取方法，分别为索氏，超声、回流及冷浸，以及提取时间。试验结果表明以乙腈超声提取35min，能全面反应狼毒全谱峰，且峰面积较大，方法简单。试验比较了乙腈-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸3种体系；以及通过二极管阵列进行检测结果表明，以乙腈-水梯度洗脱、210nm为波长时，各色谱峰均有较大的吸收，且峰

数较多，各峰分离情况良好。相似度评价结果表明，广西产地的狼毒药材与其他产地的药材存在差异。因此，在临床用药等方面应当关注药材的来源与产地。

参考文献

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Study on HPLC fingerprint of radix euphorbiae fischerianae

DengDehong1,HuJu2△

(1.HubeiXiaoganLeprosyPreventionandControlCenter,Hanchuan,Hubei431600,China;2.DepartmentofEnvironmentalEngineering，HubeiIndustrialPolytechnic，Shiyan,Hubei442000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish fingerprint of Radix Euphorbiae Fischerianae by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsThe samples were separated on Hypersil ODS(250 mm × 4.6 mm,5 μm) column with gradient mobile phase of acetic-water,the column temperature was 20 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min and UV detection wavelength was 210 nm.the sample injection was 20 μL.Results15 samples of different origin Radix Euphorbiae Fischerianae were detected and each chromatographic peak was separated well with conforming to the requirements of fingerprint by calibrating the 15 peaks.15 common peak retention time RSD，relative peak area RSD were 3.7%,3.6% or less respectively；The chromatographic peak separation degree was better，similarity was higher，15 batches of different sources of stellera medicinal materials,in addition to the Guangxi nanning medicine material similarity was 0.858,other origin medicine material similarity above 0.95.Have reached the technical requirements of traditional Chinese medicine (TCM) fingerprint.ConclusionThe method is accurate,reliable,and the HPLC fingerprint shows good repeatability,which can be used for one of the quality control of Radix Euphorbiae Fischerianae.

Key words:Radix Euphorbiae Fischerianae;high performance liquid chromatography;fingerprints;quality control

(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.006

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)04-0447-03

作者简介：邓德红，男，副主任技师，主要从事检验方法学研究。△通讯作者，E-mail:734339604@qq.com。