13种链球菌超抗原基因的双重实时荧光PCR检测方法的建立*



·论著·

13种链球菌超抗原基因的双重实时荧光PCR检测方法的建立*

崔淑娟，石伟先，张代涛，赵家琛，卢桂兰，刘医萌，梁慧洁，彭晓旻△，杨鹏，王全意

(北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所，北京100013)

摘要:目的建立一新的快速的链球菌超抗原基因检测方法，能快速、灵敏及特异地分析样本中存在的各种超抗原基因。方法根据13种链球菌超抗原基因的保守序列设计特异性引物和探针,利用13种超抗原的阳性标本作为模板来优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异度与灵敏度。结果利用该研究建立的双重荧光PCR方法体系，可以特异性鉴定出13种链球菌超抗原，并且与其他呼吸道病原菌也没有交叉反应。另外，该检测体系的检测灵敏度高于普通PCR至少 1～2个数量级(10～100倍)及以上。结论该研究建立的双重实时荧光PCR法能更加准确、快速地对链球菌菌株中的超抗原基因进行检测分析。

关键词:链球菌；超抗原；双重实时荧光聚合酶链反应

酿脓链球菌(GAS)是人类最常见和重要的致病菌之一。90%的链球菌感染疾病是由GAS引起的[1-2]。GAS可以产生大量的毒力致病因子，包括多种黏附分子和30余种外分泌蛋白，如链球菌超抗原、溶细胞素、蛋白酶、DNase和各种各样的水解酶等。目前已知GAS的超抗原包括SpeA、SpeC、SpeG、SpeH、SpeI、SpeJ、SpeL、SpeK、SpeM、Ssa和SmeZ,共有11种。另外，化脓链球菌细胞外蛋白酶SpeB和SpeF也表现出超抗原的活性。超抗原是导致侵袭性链球菌感染的重要毒力因子。因此，基于各种超抗原的研究对于链球菌的深入研究及其流行病学的研究就显得非常重要。Meisal等[3]建立了用普通PCR法对GAS超抗原进行分型检测，但是由于普通PCR的灵敏度较低、操作繁琐而局限了该方法的应用。因此，本课题拟建立一种全新的链球菌超抗原基因双重实时荧光PCR检测方法，能够快速、灵敏及特异地鉴定13种超抗原基因。

1材料与方法

1.1标本灵敏度检测标本：SpeA、SpeC、SpeG、SpeH、SpeI、SpeJ、SpeL、SpeK、SpeM、Ssa、SmeZ、SpeB和SpeF阳性标本各1例。每个标本分别进行10倍梯度稀释，每个标本共计5个浓度，即原液、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000倍稀释。特异度检测标本：肺炎支原体(MP)、流行性脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、B族链球菌(FT67)、G族链球菌(XCN14)各1例。

1.2仪器与试剂CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，普通PCR仪life Express(大和公司，日本)，凝胶图象分析系统BioSenSC300(上海山富科学仪器有限公司)；Taq酶(Promega，美国)、琼脂糖(西班牙)、DNA 标记物 DL2000(TAKARA)、引物(上海英骏公司合成)等。

1.3方法

1.3.1核酸提取取100 L标本直接加入100 L核酸抽提液，充分混匀，沸水浴10 min，然后13 000 r/min离心5 min，取上清4 L作为PCR反应模板。

1.3.2普通定性PCR利用普通PCR法对13种型别的链球菌超抗原样本的各稀释度标本以及肺炎支原体(MP)、流行性脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、B族链球菌(FT67)、G族链球菌(XCN14)进行检测，扩增引物及反应条件见表1[3]。

1.3.3双重实时荧光PCR根据NCBI上登录的13种超抗原的基因序列，针对各自保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，并由上海英俊公司合成(具体序列及组合见表2)。检测体系(40 L)根据上海之江生物科技股份有限公司链球菌超抗原检测试剂盒的说明书进行配制，反应条件为94 ℃预热2 min；再按93 ℃预热15 s，55 ℃扩增60 s，循环40次；单点荧光检测温度为55 ℃。荧光通道检测选择：选用FAM和VIC/HEX双通道。Ct值小于或等于38确定为阳性。

表1　　普通定性PCR所用引物及扩增参数

表2　　13种超抗原的双重实时荧光PCR方法的配伍及

2结果

2.1特异度检测结果分别用普通定性PCR和双重实时荧光PCR对13种链球菌超抗原样本、肺炎支原体、流行性脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌标本进行检测，结果表明，普通定性PCR和双重实时荧光PCR能特异性检测出13种链球菌超抗原样本，而肺炎支原体、流行性脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌标本则均为阴性。

2.2灵敏度检测结果分别对13种链球菌超抗原的各自5个10倍梯度稀释样本同时进行普通定性PCR和双重实时荧光PCR检测，普通定性PCR电泳图见图1(以SpeA和SpeL组合为例)，双重实时荧光PCR扩增曲线图见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)(以SpeA和SpeL组合为例)。从结果上看，实时荧光PCR的检测下限要低于普通定性PCR，普通定性PCR最多只能检测到1∶100的稀释浓度，而实时荧光PCR则至少能检测到1∶1 000的稀释浓度以上。在13种链球菌超抗原中，SpeC、SpeG和SpeM的实时荧光PCR检测灵敏度高于普通定性PCR 1个数量级(10倍)，而其他10种超抗原实时荧光PCR检测灵敏度均高于普通定性PCR 2个数量级(100倍)及以上。

M：DNA标记物D2000；1～5：SpeA阳性样品的5个梯度稀释样品(模板浓度由原液、10-1～1∶10-4)扩增产物；6：阴性对照；7～11：SpeL阳性样品的5个梯度稀释样品(模板浓度由原液、10-1～1∶10-4)扩增产物；12：阴性对照。

图1SpeA和SpeL普通定性PCR扩增图

3讨论

链球菌严重威胁人类的健康，它能分泌包括超抗原在内的一系列毒力因子，这些毒力因子在多种感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤的发病机制中起重要作用。超抗原以MHCⅡ类分子依赖或非依赖的方式，与TCR Vβ结合激活T细胞，比普通抗原高1 000～100 000倍左右[4]。因此，研究超抗原基因在链球菌菌株中的分布，有助于链球菌致病机制的深入研究，便于更好地指导临床感染性疾病和自身免疫性疾病的治疗。

研究发现，超抗原基因在链球菌菌株中的分布存在不稳定性，各个地区的超抗原基因存在情况也有所差异。因此需要开展链球菌菌株中超抗原基因的流行性调查。近年来分子生物学的发展为超抗原基因的检测提供了很好的技术条件。如Meisal等[3]建立的普通定性PCR检测超抗原基因技术，它能快速地对链球菌菌株中的各种超抗原基因进行检测。但是由于普通定性PCR的灵敏度较低，且其操作复杂，易造成污染。因此该方法已不符合当前的发展需要。近年来，在普通PCR基础上发展起来的实时荧光定量PCR将核酸检测的特异度和灵敏度大大提高。它克服了常规PCR易造成实验室污染的缺点，保持了灵敏度、特异度高的优点，还能进行准确定量，使常规PCR实现了从定性[4-8]到定量[9-12]的革命性飞跃。由于整个扩增和检测过程均为闭管操作，不需开盖吸取扩增产物进行电泳，避免了PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果，广泛用于临床病原体的检测[13-15]。

本研究基于实时荧光定量PCR技术平台建立了链球菌超抗原基因双重实时荧光PCR检测方法，并将其与普通定性PCR法从灵敏度和特异度两个方面进行比较研究。结果发现荧光PCR的灵敏度要明显高于普通PCR，其敏感性至少要高于普通定性PCR 1个数量级以上。在特异度方面，用普通定性PCR和实时荧光PCR法分别对其他相似菌株MP、流行性脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、MRSA进行检测，检测结果均为阴性，这表明实时荧光PCR法检测链球菌超抗原基因的特异度与普通定性PCR法相当。因此，本研究建立的实时荧光PCR法能更加准确、快速、灵敏地对链球菌菌株中的超抗原基因进行检测分析。

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Development of a duplex real-time PCR assay for detecting 13 streptococcal superantigens*

CuiShujuan,ShiWeixian,ZhangDaitao,ZhaoJiachen,LuGuilan,LiuYimeng,LiangHuijie,PengXiaomin△,YangPeng,WangQuanyi

(InstituteforInfectiousDiseaseandEndemicDiseaseControl,BeijingCenterforDiseasePreventionandControl,Beijing100013,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a duplex real-time PCR assay for rapid,sensitive,specific detection of 13 streptococcal superantigens.MethodsPrimer and probe sequences were selected based on the highly conserved region from an alignment of nucleotide sequences of the 13 streptococcal SAgs.The reaction conditions of the duplex real-time PCR were optimized and the specificity and sensitivity of the duplex assay was evaluated using SAg positive strains.Results13 SAgs were able to differentiated using the duplex assay and there was no cross-reaction with non-Streptococcus bacteria.On the other hand,the limit of detection of the duplex assay was at least one or two log dilutions higher than that of the conventional PCR.ConclusionThe study of duplex real-time PCR assay can identified 13 streptococcal superantigens accurately and fastly.

Key words:streptococcal;superantigens;duplex real-time fluorescent polymerase chain reaction

(收稿日期：2015-10-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.004

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)04-0441-03

基金项目：北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目(2013-3-098)；北京市青年拔尖人才项目(2014000021223ZK36)。

作者简介：崔淑娟，女，副研究员，主要从事呼吸道病原体的研究。△通讯作者，E-mail:pengxiaomin@bjcdc.org。