大鼠酒精性肝损害与FTIR光谱相关性的研究

李石磊

作者单位：　吉林市第二人民医院　132011



大鼠酒精性肝损害与FTIR光谱相关性的研究

李石磊

作者单位：吉林市第二人民医院132011

【摘要】目的本研究将FTIR技术用于大鼠酒精性肝病理模型检测，通过谱图能反映出肝细胞酒精性损害的微小变化，FTIR技术快速、精确、简便，可以在分子水平为酒精性肝病的早期诊断提供依据，为临床研制开发酒精性肝病新药及疗效判定提供基础理论依据。方法本实验通过90只雌雄性Wistar大鼠灌胃40%浓度酒精9ml/kg体重，获取60例大鼠酒精性肝损害组织和30例正常肝组织标本，应用FTIR光谱仪进行扫描。对获得的酒精性肝损害组织图谱应用Spapro2软件分析，测定参数包括组织图谱峰强、峰位、半峰宽，并计算峰强比值。结果正常肝组织和酒精性肝损伤组织间红外光谱有统计学差异，光谱技术检测的酒精性肝组织同病理学诊断金标准的结果进行比较，此判别方法的灵敏度和特异度为96.7%。结论FTIR光谱技术可以达到快速准确的鉴别酒精性肝损害的目的。

【关键词】傅里叶红外光谱技术染色酒精性肝损害大鼠动物模型

酒精性肝病是一类非常复杂的肝脏损伤病变，它是由长期大量饮酒所引起的。酒精性肝病病理学特点是渐进性肝损害，肝组织和细胞均发生很大变化，重要的大分子物质(包括蛋白质、脂类、糖原及核酸等)在含量、构型及构象方面均出现很大改变，但是相应的临床表现及影像学表现(主要为CT、磁共振及超声)不甚明显，故早期发现小分子物质改变并确诊本病是研究重点。傅里叶变换红外光谱(FTIR)可以检出物质的结构、成分等变化，因此可以应用该技术来检测细胞内蛋白质、脂类物质、糖原及核酸等成分变化情况，从而早期诊断。本研究将FTIR技术用于大鼠酒精性肝病理模型检测，通过谱图能反映出肝细胞酒精性损害的微小变化，FTIR技术快速、精确、简便，可以在分子水平为酒精性肝病的早期诊断提供依据，为临床研制开发酒精性肝病新药及疗效判定提供基础理论依据。

1.材料与方法

1.1材料采用酒精灌胃方法。本实验通过90只雌雄性Wistar大鼠灌胃40%浓度酒精9ml/kg体重，每天给酒2次。观察大鼠表现及大体变化、一般情况、体重情况及病理超微结构的变化，约8周建立成动物模型。造模组中随机选出两只大鼠,观察其肝组织的病理学改变情况，发现大量的肝细胞出现小泡性脂肪变性，表明酒精性肝病模型的初步成型。造模成功后，杀鼠，采取血液及肝脏,并制作大鼠肝脏石蜡切片，HE染色分析病理变化。获取60例大鼠酒精性肝损害组织和30例正常肝组织标本，应用FTIR光谱仪进行扫描。

1.2傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析应用OMNIC软件进行光谱取。对获得的酒精性肝损害组织图谱应用Spapro2软件分析，测定参数包括组织图谱峰强、峰位、半峰宽，并计算峰强比值，1460cm-1是峰强中最稳定的谱带参数，因而使用此点的峰强进行相对峰强比值的计算。

1.3统计学方法比较两组各参数，数据资料分析时使用的的软件为SPSS 19.0，对收集到的呈正态分布的信息行t检验，非正态分布行Mann.Whitney U检验方法，用P<0.05来表示正常肝组织和酒精性肝损伤组织间红外光谱的差异具有统计学意义。最后得出其敏感性及特异性，并将判别分类结果同病理金标准进行比较。

2.结果

2.1正常肝组织和酒精性肝损害组织之间的红外光谱差异正常情况下，检测肝组织的核酸分子中磷酸二酯基团(PO-2)的傅里叶红外光谱，发现波峰处在1079cm附近，发生酒精性肝损害后波峰会向高波数移动约3cm-1，除幅度变大外，相应吸收强度也会增强，这表明发生酒精化的肝细胞的DNA数量大大增加；处在1240cm-1附近的波峰也增加波动的幅度，即向高波数移动了大约3cm-1，相应吸收强度也会增强，这表明发生酒精化的细胞内核酸氢键化程度降低。获得红外光谱图后，分别测量正常肝组织和酒精肝损伤组织中糖原和核酸分子的波峰，并分别计算各个组织中糖原和核酸的比值，发现发生酒精性损伤后该比值大大减低，这表明酒精化肝细胞中，相对于核酸来说，糖原成分的降低更加明显。对获得红外光谱中蛋白质C-O基团的图谱进行分析，检测到正常肝细胞的振动峰大约在1164cm-1上，发生酒精化后，其数值明显发生变化，向高波数移动约11cm-1，这表明发生酒精肝损害的肝细胞内大多数的分子间氢键均受到影响，遭到破坏。酒精性肝损害肝细胞膜中脂类成分的C-H基团的红外吸收光谱发现C-H3和CH2官能团的数量比例较正常时加大，可能是表明脂质的亚甲基链出现了结构变化。两组各吸收峰的峰位对比情况见表1。

表1　两组各吸收峰的峰位对比情况

2.2判别方法的准确性选取30例FTIR光谱技术检测的酒精性肝组织同病理学诊断金标准的结果进行比较，此判别方法的灵敏度和特异度均为96.7%(见表2)。

表2　组织标本FTIR光谱分析结果与病理学金标准的比较

3.讨论

3.1傅里叶红外光谱(FTIR)检测酒精性肝病目前诊断酒精性肝病的辅助检查手段包括超声、CT及核磁振成像，其中以超声应用最为广泛。但是，超声虽然操作简单，可重复性强，但存在一定的局限性，疾病的诊断与图像质量、诊断医师以及技术人员临床经验密切相关。基于这一现状，国内外学者就脂肪性肝病的诊断开展了深入研究，目前的研究热点就是傅里叶红外光谱。有学者研究表明[1，2]，和NFLD相比，脂肪性肝病中很多的脂肪成分均表现为明显增高，相应的HDL却显著降低。这为傅里叶红外光谱应用于酒精性肝损害提供了依据。

本研究发现对照组磷酸二酯基团对称性伸缩振动的吸收峰约为1079cm-1，酒精组该吸收峰出现蓝移，幅度约3cm-1，同时吸收强度明显增大。有外国学者称，肝细胞核中核酸含量高低会影响相应的吸收强度，说明酒精性肝损害细胞核DNA含量大大增加；正常组磷酸二酯基团非对称性伸缩振动的吸收峰约为1240cm-1，酒精组该吸收峰出现蓝移，幅度约3cm-1，这主要是因为损害肝组织中官能团PO-2产生很多氢键。酒精性脂肪变后可能会引起磷酸化蛋白分子磷酸单酯中二价阴离子在红外光谱图像上的对称伸缩振动出现改变。对于脂质来说，本研究发现酒精性肝损害后肝组织的脂质发生了巨大变化，并且变化呈现出一定的规律性，与病理结果吻合，说明对于酒精性肝病，FTIR光谱可以作为有效的分子诊断手段。

本研究获得并分析大鼠酒精性肝损害光谱信息，并转换为相应的计量数据，从而建立酒精性肝损害的校正模型。在模型确定后进入验证阶段。FTIR技术主要的操作内容有：①测定样品的硬件信息；②将得到的信息通过特定的软件换算为计量数据，并建立矫正模型；③针对分析任务建立的校正模型。有学者应用显微红外光谱法对肝移植患者进行检测[3]，发现该方法能在病理检查显示正常的非脂肪变性检测出脂类物质的不同密度变化，这说明该方法能够更加精确地检测出肝脏组织中细微的化学变化，降低漏诊率。有学者采用无创、简单的检查方式——近红外光谱仪来进行采集、处理数据，即将数据信息转化为归一化反射率。实验预测其准确率接近90%。作为全新检查方式，该技术具有广泛和光明的应用前景。光谱技术可以对不同物质进行全面、客观的定量和定性分析，精确度高，实用性强。

3.2FTIR的优势FTIR的主要优点为[4]：①相对于传统技术，做到了多通道测量，大大提升信噪比(SNR)：FTIR采用的技术为对傅里叶变换对光的信号进行处理，所用的光学元件少，避免了电机驱动棱镜和光栅光谱仪所带来的误差，降低了光的损耗，而且通过干涉进一步增加了光的信号，使得检测器的辐射强度增大，重现性好，从而做到了高信噪比[5]；②扫描迅速，灵敏度好：傅里叶变换红外光谱仪是按照全波段进行数据采集的，没有入射和出射狭缝限制，光谱范围宽，范围约10000～10cm-1，因而光通量高，完成一次完整的数据采集只需要1秒钟左右，大大提高运作速度及灵敏度，而色散型仪器一次只能测试很窄的频率范围，操作时间长，效率低[6]；③精确度高：傅里叶红外光谱可以检测出分子中细微讯息[7]；④分辨能力强：可以鉴定出相似度高的分子间的不同；⑤应用范围广：设计到的波段范围广，甚至能够检测远红外光谱[8]；⑥其他：重复性及错误率大大降低，周围不相关光线的干扰小，应用起来方便，实现了自动化，经济实用。鉴于傅里叶变换红外光谱仪的众多优势，目前它已经成为红外光谱仪中应用最为广泛的仪器，并且在脂肪性肝病的应用方面取得重大进展。

3.3FTIR的局限性与展望虽然FTIR有很大的应用优势,但仍有目前无法突破的不足。傅里叶红外光谱所得结果的稳定性受到分析仪器、样本选择以及操作者的影响。此外，分散性物质使用FTIR技术的效果欠佳。该技术操作过程中需要耗费很大的精力来建立一个精确的矫正模型，因此操作相对繁琐，不能得到广泛应用，仅能作为间接的分析技术，对于需要经常操作的分析也是既经济又方便的方式，但对于偶尔进行的分析或是分散性样品不太适用。该技术不适用于痕量分析。测试的灵敏度还是需要提高，要求被测物质分子的含量在0.001以上[9]。我国虽然在傅里叶红外光谱仪的换算方法研究、关键软件开发以及在脂肪性肝病的应用研究方面取得了很大的成绩,但和国外的先进技术水平相比，还有很大差距。目前在FTIR最新研究包括FTIR技术来定量分析微生物二元混合体系的成分，FTIR光谱的一种新的应用CMIA，光纤系统等。虽然目前在傅里叶红外光谱技术已经取得很大进步，并得到广泛应用，尤其是在医学研究中取得重大成就，但还有很大的探讨研究空间。不过，笔者相信，随着我国技术的发展以及学者对于红外光谱的深入研究,傅里叶红外光谱分析技术作为一种经济、实用、方便、快速、有效的分析技术，在脂肪性肝病的应用上还有很大进步空间。

总之,傅里叶红外光谱不同于传统的分析方式，避免了繁琐的操作,做到了快速自动化，而且方便实用，经济有效,分辨率及信噪比高。相信在学者不懈的努力下，积累经验，接受教训，提高信息换算方式,FTIR分析技术运用于医学方面，尤其是在酒精性肝损害诊断的深度和广度上将不断向前发展。

参考文献

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Research Correlation in Rats with Alcoholic Liver Damage and the FTIR Spectrum

(LIShilei.Thesecondpeople’shospitalofjilincity,Jilin132002,China.)

【Abstract】ObjectivesThis research will FTIR technology used in rats with alcoholic liver disease model checking, through the spectrum diagram can reflect the subtle change of alcoholic liver cell damage, FTIR technology is fast, accurate, convenient, can at the molecular level to provide the basis for early diagnosis of ALD, for clinical research and development of ALD drugs provide theory basis. MethodsUsing the ethanol lavage method. This experiment through 90 female male Wistar rats by gastric 40% concentration alcohol 9 ml/Kg weight,for 60 cases of alcoholic liver injury in rats and 30 cases of normal liver tissue samples, using an FTIR spectrometer. For the organization of alcoholic liver damage map application Spapro2 software analysis, determination of parameters including atlas peak, peak, half peak width, and calculate the peak intensity ratio. ResultsCompare two groups of various parameters, to test for normal distribution and non-normal distribution line Mann. Calculate sensitivity and specificity96.7%,discriminant classification results with the pathological gold standard for comparison FTIR. ConclusionsFTIR spectroscopy can achieve rapid, accurate identification of the purpose of the alcoholic liver damage.

【Key words】FTIR, Dye, Alcohol liver disease(ALD)，Animal model, Rats

收稿日期：2016-1-12

作者简介：李石磊，本科学历，主要从事肿瘤诊断工作10年，擅长各种肿瘤的诊疗及防治。

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.01.002