双标染色技术在大鼠脑创伤后caspase-3与神经细胞凋亡研究中的应用

宋朝彦+董晓辉+谢东

[摘要] 目的 探讨末端标记（TUNEL）法与caspase-3免疫组织化学法双标染色技术在研究大鼠神经细胞凋亡机制中应用的优越性。 方法 雄性Wistar大鼠12只随机分成两组，用Marmarou方法造成大鼠重型弥漫性颅脑创伤。切片先按照试剂盒提供的方法行TUNEL染色显示凋亡，再按caspase-3免疫组化试剂盒检测方法继续染色。 结果 双标染色显色满意，大鼠海马区大部分TUNEL阳性细胞同时也表现caspase-3阳性。结论 caspase-3与TUNEL双标染色能更好的反映出大鼠脑创伤后caspase-3与凋亡之间的关系，体现了双标染色技术的优越性。

[关键词] 大鼠；免疫组织化学；双标染色；凋亡

[中图分类号] R651.15[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）19-0025-03

Double staining techniques in the study of caspase-3 and the apoptosis after traumatic brain injury in rats

SONG Chaoyan DONG Xiaohui XIE Dong

Department of Neurosurgery,Baoding City the First Hospital in Hebei Province，Baoding 071000，China

[Abstract] Objective To explore the advantage of double staining TUNEL in situ and immunohistochemical technique of casepase-3 expression following traumatic brain injury(TBI) in rats.Methods 12 male Wistar rats were randomly divided into 2 groups. According to Marmarou, severe closed brain injury was made. After that, TUNEL in situ was applied of the apoptosis cell in hippocampus region. Then immunohistochemical staining with Caspase-3 were performed of hippocampus region. Results Double staining was well showed that TUNEL positive cell appeared in hippocampus and Caspase-3 appeared in the same cell. Conclusion TUNEL and Caspase-3 double staining better reflect the relationship between caspase-3 and apoptosis following TBI in rats. Double staining showes the advantage in the relation of apoptosis and Caspase-3.

[Key words] Rats; Immunohistochemistry; Double staining; Apoptosis

双标染色技术目前在免疫组织化学已经普遍采用[1，2]，但双标染色技术要求相对较高，切片染色成功率低，尤其对初学者由于细节方面的忽视，难以获得满意的染色结果。而关于双标染色技术的专门研究文章较少，本实验利用大鼠颅脑创伤（TBI）模型，大鼠TBI后通过对海马组织进行caspase-3免疫组化与末端标记（TUNEL）法染色，探讨双标染色技术在研究神经细胞凋亡机制中应用中的注意事项及优越性。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

健康Wistar雄性大鼠（河北医科大学实验动物中心提供）12只，体重250～300 g。大鼠随机分成对照组、创伤组。其中创伤组8只（实际存活5只大鼠，由于模型死亡造成），对照组4只大鼠。

1.2大鼠创伤模型制备及取材

仿Marmarou方法[3]并根据实际情况加以改进建立模型，大鼠以腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉，头皮切开后采用450 g×1.5 m自由落体打击大鼠顶骨制作大鼠脑损伤模型。对照组仅予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤。于伤后3 d经心灌注前固定，断头取脑，取大脑部分前囟后3.3~4.3 mm间行后固定。常规脱水、石蜡包埋，标本行连续冠状切片，厚度约7μm，置于经粘片剂处理过的载玻片上备用。

1.3 末端标记（TUNEL）法与caspase-3免疫组化双标染色

TUNEL检测试剂盒购自美国Roche公司，转换液为碱性磷酸酶标记。所用caspase-3一抗购自美国Santa Cruz公司，SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。石蜡切片经二甲苯脱蜡梯度酒精至水。首先严格按TUNEL试剂盒所要求步骤进行操作（空白对照[4]只加不含酶等量核苷酸反应液，余相同），用BCIP/NBT显色液显色（细胞核呈蓝紫色为显色阳性），避光室温下显色约20 min，显微镜下显色满意后，用0.01M PBS液冲洗2～3次终止显色。用蒸馏水冲洗去除切片残余试剂。切片再次严格按caspase-3免疫组化说明书步骤操作。空白对照用0.1M PBS液代替一抗其余步骤相同。DAB显色剂显色约20 min，显微镜下显色满意后（细胞浆呈黄色为显色阳性），清水充分冲洗，经酒精及二甲苯依次处理后，中性树胶封片。

2结果

对照组未见明显染色。创伤组大部分TUNEL标记阳性细胞（细胞核呈蓝色）同时也表现caspase-3免疫染色阳性（细胞浆呈棕黄色），除此小部分TUNEL标记阳性细胞未见caspase-3免疫染色阳性，另外也有小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL标记阳性。TUNEL空白对照仅显示caspase-3染色阳性，caspase-3空白对照仅显示TUNEL染色阳性（图1～3）。

图1 创伤组大鼠海马区神经细胞TUNEL与caspase-3双标染色400×（可见caspase-3染色与TUNEL染色）

图2 双标染色TUNEL空白对照400×（仅显示caspase-3染色阳性）

3讨论

近年来，由于免疫组织化学的迅速发展，单克隆抗体的不断产生，因此人们对免疫组化技术的要求也越来越高，不仅仅满足于免疫组化的单一标记，而且需要双重或多重标记，其基本原理是根据标记物的不同，各自所标记的抗原呈现不同的颜色，在一张切片上或同一细胞内显示两种以上的抗原，光镜或荧光镜下根据不同的颜色来判断不同的抗原成分。利用这种技术可以了解到组织细胞间的形成和机能的关系，以及抗原成分相互之间的关系，为基础理论的探讨，发病机制的研究、疾病的诊断提供了重要的实验手段。

endprint

由于双标染色过程复杂，所需时间长，对切片的质量要求极高，因此在制作石蜡切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片过程中讲究技巧以制作优良的切片。这要求取材脱水一定要彻底，石蜡包埋时一定要达到浸蜡的均一，防止脱水不彻底而造成的组织包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的转移，在转移到恒温水浴箱中不要出现切片重叠。水温应合适，水温过高易造成切片过度分散，水温过低展片时间过长且不易平整。水浴箱中避免气泡的产生，防止切片漂到气泡上，捞片过程中注意不要在切片和载玻片中间留有气泡，造成切片不平整且易从载玻片上脱落影响后续操作及染色。烤片采用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时间过短也会造成脱片。由于染色过程中需数次振荡洗涤切片，防脱片非常重要，载玻片应用粘片剂等防脱片技术预防切片脱片。这些技术细节一定要重视，否则可能导致事倍功半。在我们的试验中，由于在caspase-3免疫组化染色过程中需抗原热修复[5]，而TUNEL原位凋亡染色步骤相对较少，对切片影响小，因此染色顺序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，防止抗原热修复对DNA造成损伤。

目前虽有全自动免疫组化仪的应用[6]，节省人力，规范自动化，但其自动化步骤不灵活，期间废片不能检出，造成试剂的浪费，增加了试验成本，尤其是第一次染色后，仍需人工判定切片是否可以继续进行第二次标记染色。因此在双标染色中不主张应用全自动免疫组化仪。染色过程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附多余的水分，防止试剂稀释影响染色，同时所加抗体量要足，充分覆盖切片，滴加抗体后孵育时间要充足，同时应放在湿盒中防止干燥，以免染色不均。

双标染色可以用单酶或两种酶系统进行染色。利用单酶做双标染色的主要不利因素为第一次标记抗体的残留部分不易洗去，易造成假阳性反应。虽然可以在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有一定误差。用两种酶分别标记两种不同的抗原，可以避免非特异性交叉反应，两种酶反应系统互不干扰，显色清晰可靠。因此目前研究中多用两种酶标记不同的抗原进行显色。本实验为防止染色系统的干扰应用过氧化物酶反应系统DAB显色剂显色显示caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反应系统NBT显色液显色显示凋亡细胞（呈蓝紫色），同时保证在第一次染色后颜色不能被后续步骤洗脱。

已经证实大鼠颅脑创伤后海马区神经细胞可产生凋亡[7]。触发凋亡的途径很多[8]，但大多通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反应，caspase-3被认为是caspases家族中的关键蛋白酶[9]，TUNEL法通过标记凋亡细胞染色体DNA断裂后可产生大量的粘性3′-OH末端特定的断裂端，因而是检测凋亡的重要方法[10]。在我们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL标记同时也表现阳性，说明细胞凋亡大部分是通过caspase-3介导的[11]。同时在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这说明有一部分细胞可能是通过其他途径凋亡的。同时一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL标记阳性，说明caspase-3所介导的凋亡过程中由于凋亡抑制因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能继续，部分细胞有存活下来的希望。双标染色技术可以在同一张切片中展示上述关系，很好的说明了这个问题。双标染色技术不但可以在此应用，也可用于类似的研究中，是一项富有生命力的技术。

[参考文献]

[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.

[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.

[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.

[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.

[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．

[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．

[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.

[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.

[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.

[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.

[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.

（收稿日期：2014-03-10）

文题

文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般使用能充分反映论文主题内容的短语，不使用具有主、谓、宾结构的完整语句，一般不使用标点和缩略语。

中文文题一般不宜超过20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可采用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区分。

endprint

由于双标染色过程复杂，所需时间长，对切片的质量要求极高，因此在制作石蜡切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片过程中讲究技巧以制作优良的切片。这要求取材脱水一定要彻底，石蜡包埋时一定要达到浸蜡的均一，防止脱水不彻底而造成的组织包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的转移，在转移到恒温水浴箱中不要出现切片重叠。水温应合适，水温过高易造成切片过度分散，水温过低展片时间过长且不易平整。水浴箱中避免气泡的产生，防止切片漂到气泡上，捞片过程中注意不要在切片和载玻片中间留有气泡，造成切片不平整且易从载玻片上脱落影响后续操作及染色。烤片采用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时间过短也会造成脱片。由于染色过程中需数次振荡洗涤切片，防脱片非常重要，载玻片应用粘片剂等防脱片技术预防切片脱片。这些技术细节一定要重视，否则可能导致事倍功半。在我们的试验中，由于在caspase-3免疫组化染色过程中需抗原热修复[5]，而TUNEL原位凋亡染色步骤相对较少，对切片影响小，因此染色顺序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，防止抗原热修复对DNA造成损伤。

目前虽有全自动免疫组化仪的应用[6]，节省人力，规范自动化，但其自动化步骤不灵活，期间废片不能检出，造成试剂的浪费，增加了试验成本，尤其是第一次染色后，仍需人工判定切片是否可以继续进行第二次标记染色。因此在双标染色中不主张应用全自动免疫组化仪。染色过程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附多余的水分，防止试剂稀释影响染色，同时所加抗体量要足，充分覆盖切片，滴加抗体后孵育时间要充足，同时应放在湿盒中防止干燥，以免染色不均。

双标染色可以用单酶或两种酶系统进行染色。利用单酶做双标染色的主要不利因素为第一次标记抗体的残留部分不易洗去，易造成假阳性反应。虽然可以在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有一定误差。用两种酶分别标记两种不同的抗原，可以避免非特异性交叉反应，两种酶反应系统互不干扰，显色清晰可靠。因此目前研究中多用两种酶标记不同的抗原进行显色。本实验为防止染色系统的干扰应用过氧化物酶反应系统DAB显色剂显色显示caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反应系统NBT显色液显色显示凋亡细胞（呈蓝紫色），同时保证在第一次染色后颜色不能被后续步骤洗脱。

已经证实大鼠颅脑创伤后海马区神经细胞可产生凋亡[7]。触发凋亡的途径很多[8]，但大多通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反应，caspase-3被认为是caspases家族中的关键蛋白酶[9]，TUNEL法通过标记凋亡细胞染色体DNA断裂后可产生大量的粘性3′-OH末端特定的断裂端，因而是检测凋亡的重要方法[10]。在我们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL标记同时也表现阳性，说明细胞凋亡大部分是通过caspase-3介导的[11]。同时在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这说明有一部分细胞可能是通过其他途径凋亡的。同时一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL标记阳性，说明caspase-3所介导的凋亡过程中由于凋亡抑制因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能继续，部分细胞有存活下来的希望。双标染色技术可以在同一张切片中展示上述关系，很好的说明了这个问题。双标染色技术不但可以在此应用，也可用于类似的研究中，是一项富有生命力的技术。

[参考文献]

[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.

[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.

[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.

[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.

[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．

[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．

[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.

[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.

[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.

[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.

[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.

（收稿日期：2014-03-10）

文题

文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般使用能充分反映论文主题内容的短语，不使用具有主、谓、宾结构的完整语句，一般不使用标点和缩略语。

中文文题一般不宜超过20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可采用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区分。

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由于双标染色过程复杂，所需时间长，对切片的质量要求极高，因此在制作石蜡切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片过程中讲究技巧以制作优良的切片。这要求取材脱水一定要彻底，石蜡包埋时一定要达到浸蜡的均一，防止脱水不彻底而造成的组织包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的转移，在转移到恒温水浴箱中不要出现切片重叠。水温应合适，水温过高易造成切片过度分散，水温过低展片时间过长且不易平整。水浴箱中避免气泡的产生，防止切片漂到气泡上，捞片过程中注意不要在切片和载玻片中间留有气泡，造成切片不平整且易从载玻片上脱落影响后续操作及染色。烤片采用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时间过短也会造成脱片。由于染色过程中需数次振荡洗涤切片，防脱片非常重要，载玻片应用粘片剂等防脱片技术预防切片脱片。这些技术细节一定要重视，否则可能导致事倍功半。在我们的试验中，由于在caspase-3免疫组化染色过程中需抗原热修复[5]，而TUNEL原位凋亡染色步骤相对较少，对切片影响小，因此染色顺序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，防止抗原热修复对DNA造成损伤。

目前虽有全自动免疫组化仪的应用[6]，节省人力，规范自动化，但其自动化步骤不灵活，期间废片不能检出，造成试剂的浪费，增加了试验成本，尤其是第一次染色后，仍需人工判定切片是否可以继续进行第二次标记染色。因此在双标染色中不主张应用全自动免疫组化仪。染色过程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附多余的水分，防止试剂稀释影响染色，同时所加抗体量要足，充分覆盖切片，滴加抗体后孵育时间要充足，同时应放在湿盒中防止干燥，以免染色不均。

双标染色可以用单酶或两种酶系统进行染色。利用单酶做双标染色的主要不利因素为第一次标记抗体的残留部分不易洗去，易造成假阳性反应。虽然可以在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有一定误差。用两种酶分别标记两种不同的抗原，可以避免非特异性交叉反应，两种酶反应系统互不干扰，显色清晰可靠。因此目前研究中多用两种酶标记不同的抗原进行显色。本实验为防止染色系统的干扰应用过氧化物酶反应系统DAB显色剂显色显示caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反应系统NBT显色液显色显示凋亡细胞（呈蓝紫色），同时保证在第一次染色后颜色不能被后续步骤洗脱。

已经证实大鼠颅脑创伤后海马区神经细胞可产生凋亡[7]。触发凋亡的途径很多[8]，但大多通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反应，caspase-3被认为是caspases家族中的关键蛋白酶[9]，TUNEL法通过标记凋亡细胞染色体DNA断裂后可产生大量的粘性3′-OH末端特定的断裂端，因而是检测凋亡的重要方法[10]。在我们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL标记同时也表现阳性，说明细胞凋亡大部分是通过caspase-3介导的[11]。同时在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这说明有一部分细胞可能是通过其他途径凋亡的。同时一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL标记阳性，说明caspase-3所介导的凋亡过程中由于凋亡抑制因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能继续，部分细胞有存活下来的希望。双标染色技术可以在同一张切片中展示上述关系，很好的说明了这个问题。双标染色技术不但可以在此应用，也可用于类似的研究中，是一项富有生命力的技术。

[参考文献]

[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.

[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.

[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.

[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.

[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．

[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．

[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.

[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.

[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.

[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.

[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.

（收稿日期：2014-03-10）

文题

文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般使用能充分反映论文主题内容的短语，不使用具有主、谓、宾结构的完整语句，一般不使用标点和缩略语。

中文文题一般不宜超过20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可采用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区分。

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