PDCD4对甲状腺癌SW579细胞调亡及成瘤能力的影响

谢茂云，黄耀，杨莉涛，王新根

(中山大学附属第八医院普通外科，广东 深圳 518033)

PDCD4对甲状腺癌SW579细胞调亡及成瘤能力的影响

谢茂云，黄耀，杨莉涛，王新根

(中山大学附属第八医院普通外科，广东 深圳 518033)

目的 研究程序性细胞死亡因子4(PDCD4)诱导的对甲状腺癌SW579细胞凋亡效应及抑制成瘤能力的可能作用机制。方法将对数生长期的细胞分为两组，观察组先予以PDCD4凋亡相关基因Bax的刺激14 h进行细胞的收集，然后加入tPA刺激细胞进行收集。对照组未加PDCD4凋亡相关基因Bax的刺激和tPA刺激。应用AnnexinV/PI和API等标记，Cyclins/DNA双标流式细胞仪检测甲状腺癌SW579细胞的凋亡及周期特异性，运用RT-PCR的方法检查Caspase-3、Caspase-9活化情况。结果处于静止期的外周血对PDCD4凋亡诱导不敏感，而G1期PDCD4诱导甲状腺癌SW579细胞出现了明显的细胞凋亡。PDCD4诱导的细胞凋亡主要是在细胞周期的G1期发生。观察组的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达值分别为(1.12±0.56)、(1.10±0.29)，显著高于对照组的(0.82±0.31)、(0.72±0.26)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论PDCD4诱导的细胞凋亡与甲状腺癌SW579细胞的细胞周期相关，存在G1期细胞周期阻滞的周期特异性，且此过程中发生了Caspase活化，参与细胞凋亡及可能抑制细胞成瘤能力。

程序性细胞死亡因子4；甲状腺癌SW579细胞；细胞凋亡；细胞周期；成瘤能力

甲状腺癌约占全身恶性肿瘤的1%，近年来，甲状腺癌发病率有逐年上升趋势，甲状腺癌多起病隐匿，常以无痛性甲状腺结节为最初临床表现，发病机制不明确，早期诊断较为困难。因此，研究其可能的发病机制及早期诊断预警分子，是目前甲状腺癌临床研究所面临的瓶颈问题，而程序性细胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4)是新近发现的与细胞凋亡相关的蛋白，其已被证实为是一种肿瘤抑制蛋白[1-3]。已有不少研究表明PDCD4在恶性肿瘤中较正常组织表达下调或缺失[4-5]，但具体机制不是十分明确。本研究的总体研究思路是通过细胞分子试验，以期探讨PDCD4抗甲状腺癌SW579细胞凋亡的效应、分子机制以及对成瘤能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 (1)试剂：甲状腺癌SW579细胞(中国科学院细胞库)，DMEM培养液(U.S. Promega Biological Technology CO.，Ltd.)，PCR试剂盒(北京索莱宝)，流式细胞检测用AV/PI双染、PI单染试剂购于上海索莱宝生物科技有限公司。甲状腺癌SW579细胞中组织型纤溶酶原激活剂tPA(上海碧云天生物)。(2)仪器：细胞培养超净台(苏州净化)，恒温培养箱(美国Beckman Coulter公司)，PCR仪(德国Biometra公司)，倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)，全自动低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)，FACSort流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养与传代 甲状腺癌SW579细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，去除旧培养基，加入0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶使其完全覆盖细胞，室温消化3～5 min，倒置显微镜下观察，当大部分细胞胞质回缩变圆时，吸去胰蛋白酶。加入新鲜的完全培养基，吹打贴壁细胞使之成为细胞混悬液，细胞计数，按适当比例稀释并移至另一灭菌培养瓶中。培养瓶置于细胞培养箱中，37℃、5%CO2培养，密切观察细胞的生长状态。

1.3 细胞处理与分组 待细胞贴壁生长至4×106，对数是生长期的细胞分为两组，观察组先予以PDCD4凋亡相关基因Bax的刺激14 h进行细胞的收集，然后加入tPA刺激细胞进行收集。对照组未加PDCD4凋亡相关基因Bax的刺激和tPA刺激。

1.4 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)取甲状腺癌SW579细胞定量100 mg，提取总RNA，-80℃，保存，备用。取2 μg总RNA行逆转录cDNA，-20℃，保存cDNA。人PDCD4基因引物：上游5'-TCA GCG ACA GTG GGA GT-3'，下游5'-AGC ACG GTA GCC TTA TC-3'，PCR反应由逆转录产物cDNA 2 μL以及18sRNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同组成。反应过程按照标准的RT-PCR步奏进行，反应条件为：95℃预热3 min，95℃、12 s，60℃、40 s，40个循环。接着对所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，90～100 V，30～40 min。所得的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析。内参选择18sRNA作为参照，同样完成以上PCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞的凋亡周期 采用Annexin V/PI的方法进行凋亡的检测，细胞离心去除培养基之后冷却至4℃，进行细胞洗涤，调整浓度至106/mL，取100 μL的细胞悬液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后进行流式检测。采用API的方法检测细胞的凋亡周期，对收集的细胞加入Annexin V-FITC，室温避光30 min以后用Buffer进行洗涤2次，加入不换甲醇的甲醛1 mL进行细胞固定，Buffer洗涤2次，加入PI染色剂，静置1 h之后进行流式细胞的检测。Cyclins/DNA双标流式细胞仪分析甲状腺癌SW579细胞的周期特异性，对收集的细胞采用乙醇固定过夜，将固定后的细胞用PBS冲洗2次，用TritonX-100处理5 min两次，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，用BSA稀释抗体，4℃过夜，第二日加用羊抗鼠IgG，室温静置20 min，PBS洗涤之后，加入PI和RnaseA进行DNA染色，进行流式细胞检测。

1.6 统计学方法 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，应用Mann-whitney U检验法进行两两数据之间比较，多个来自正态总体的样本均数之间的比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡情况 对数生长的甲状腺癌SW579细胞加入PDCD4诱导一定时间后，细胞凋亡率开始变化，诱导达24 h后，凋亡细胞增加了6.8%，且短期内随时间推迟，细胞凋亡率逐渐升高，表明PDCD4可以诱导甲状腺癌SW579细胞凋亡；加入tPA刺激的甲状腺癌SW579细胞再加入PDCD4诱导24 h，凋亡增加至15.2%，表明加入tPA刺激的PDCD4诱导的甲状腺癌SW579细胞凋亡影响较未加入tPA刺激的凋亡效果更明显，见图1和图2。

2.2 甲状腺癌SW579细胞进入细胞周期情况 检测甲状腺癌SW579细胞加入tPA刺激后细胞增殖的情况，结果显示，处于静止期的甲状腺癌SW579细胞加入tPA以后进入细胞周期出现了G2～M期的细胞，见图3。

2.3 细胞凋亡的细胞周期特异性 PDCD4诱导甲状腺癌SW579细胞发生在G1期，PDCD4诱导tPA刺激的甲状腺癌SW579细胞，细胞周期发生在G1期，对照组未加PDCD4诱导及tPA刺激几乎没有明显的凋亡发生。

图1 PDCD4诱导的甲状腺癌SW579细胞凋亡散点图

图2 PDCD4诱导的tPA刺激的甲状腺癌SW579细胞凋亡散点图

图3 甲状腺癌SW579细胞刺激后细胞增殖的情况

2.4 细胞周期分析结果 甲状腺癌SW579细胞处在G0期，tPA刺激之后出现在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入PDCD4诱导之后CyclinE表达下降，细胞阻滞存在G1期。

2.5 两组甲状腺癌SW579细胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达比较 通过PDCD4诱导凋亡对甲状腺癌SW579细胞的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达情况比较，观察组采用PDCD4诱导，对照组未做处理，观察凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达，结果显示观察组的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达值显著高于对照组，两组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05)，随着时间延长，观察组细胞凋亡指数逐渐升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1和表2。

表1 两组甲状腺癌SW579细胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达比较(±s)

表1 两组甲状腺癌SW579细胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达比较(±s)

组别mRNA对照组观察组t值P值Caspase-3 0.82±0.31 1.12±0.56 2.48＜0.05 Caspase-9 0.72±0.26 1.10±0.29 2.62＜0.05

表2 两组不同时相血清细胞凋亡指数变化比较(±s)

表2 两组不同时相血清细胞凋亡指数变化比较(±s)

注：与3 h比较，aP＜0.05。

组别对照组观察组t值P值3 h 1.50±0.35 23.84±5.19 24.32＜0.01 6 h 2.64±0.89 42.51±7.24a38.75＜0.01 12 h 2.87±0.43 52.51±8.12a47.36＜0.01 24 h 2.73±0.31 55.48±8.44a51.12＜0.01 F值2.84 74.25 P值0.075＜0.01

3 讨论

甲状腺癌是一种最常见的内分泌肿瘤，近年来发病率有逐年上升的趋势，同时甲状腺癌的治疗取得了较快的发展，但甲状腺癌的发病机制目前仍尚不十分明确，PDCD4作为一种新的抑癌基因，其在甲状腺癌中的表达水平如何？PDCD4对甲状腺癌有什么样的作用?能否成为甲状腺癌治疗的新靶点?肿瘤的发生发展是一个多因素参与的复杂过程，肿瘤细胞的生存凋亡与细胞周期有关，细胞周期具有高度的保守性，凋亡不会对正常机体需要的细胞产生威胁，但能够对不必要的细胞产生景区的生理调控，凋亡与细胞增殖之间有着潜在相关性，细胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的发生是细胞被阻滞在细胞周期的其中一个时相当中，然而在已有的研究中相关PDCD4诱导的甲状腺癌SW579细胞凋亡与细胞周期特异性相关的研究尚未涉及，PDCD4是如何通过细胞周期的特异性阻滞而诱导细胞凋亡的，对凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影响，本文对其凋亡及成瘤的特异性进行了阐述。

笔者在体外对甲状腺癌SW579细胞株进行培养，在未经刺激的情况下，细胞处于G0期的状态，当细胞被PDCD4诱导之后，发生凋亡的细胞较少，细胞不进入细胞周期，而在此基础上采用甲状腺癌SW579细胞中组织型纤溶酶原激活剂tPA可以激活甲状腺癌SW579细胞进入细胞周期，促使细胞增殖，细胞进入了S、G2/M期，细胞凋亡率大大增加了[6-7]。可见细胞凋亡的发生只有在进入到细胞中期之后被检测到。细胞的凋亡是否具有周期特异性，我们通过API的方法进行检测PDCD4诱导的细胞凋亡情况，在凋亡的早期细胞凋亡出现伴随着膜外翻的现象，API的方法就是利用AnnexinV与此现象的相结合，通过细胞核染色，对凋亡周期特异性进行判断，结果显示，PDCD4诱导的细胞凋亡与周期特异性的凋亡主要发生在细胞周期的G1期。细胞的周期蛋白是一类在细胞周期中特异性表达的蛋白质，可以通过刺激细胞周期的依赖性蛋白激酶使细胞有特异性周期表现，周期蛋白最大的特点就是时相性，CyclinE/DNA双标流式细胞术对细胞周期的分析主要是将细胞CyclinE的表达与细胞处的位置结合分析，可以得到细胞的详细周期信息[8]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不会出现CyclinE，其中以晚G1期表达最强，CyclinE可以完全将G0、G1很好地分开，根据本实验结果可见PDCD4诱导的细胞凋亡对甲状腺癌SW579细胞CyclinE的表达是下降的，细胞在G1期被阻滞，此过程也伴随缓则凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表达及活化。

综上所述，甲状腺癌SW579细胞在静止期的时候并没有启动周期进程，进入周期后细胞凋亡才会变得敏感，PDCD4诱导凋亡与甲状腺癌SW579细胞的周期有密切关系，会发生在特定的时相中，这样也将细胞凋亡和周期特异性做了一个很好的解释，从某方面说明了凋亡的周期性。细胞凋亡在恶性肿瘤中具有重要作用，本研究对PDCD4诱导凋亡及抑制成瘤中做了探索性的研究，对肿瘤的诱导凋亡和治疗来说有一定的临床指导意义，希望通过今后进一步动物体内实验有更多的发现和收获。

[1]Biyanee A,Ohnheiser J,Singh P,et al.A novel mechanism for the control of translation of specific mRNAs by tumor suppressor protein Pdcd4:inhibition of translation elongation[J].Oncogene,2014,34 (11):1384-1392.

[2]Poria DK,Guha A,Nandi I,et al.RNA-binding protein HuR sequesters microRNA-21 to prevent translation repression of proinflammatory tumor suppressor gene programmed cell death 4[J].Oncogene, 2016,35(13):1703-1715.

[3]Goke R,Barth P,Sehmidt A,et al.Pmgrammed cell death protein 4 suppresses CDKI/edc2 via induetion ofp 21(Wfll/Cipl)[J].Am J Physiol Cell Physiol,2014,286(6):1541-1546.

[4]Epis MR,Barker A,Giles KM,et al.The RNA-binding protein HuR opposes the repression of ERBB-2 gene expression by microRNA miR-331-3p in prostate cancer cells[J].J Biol Chem,2011,286(48): 41442-41454.

[5]Wang YQ,Guo RD,Guo RM,et al.MicroRNA-182 promotes cell growth,invasion,and chemoresistance by targeting programmed cell death 4(PDCD4)in human ovarian carcinomas[J].J Cell Biochem, 2013,114(7):1464-1473.

[6]Yang J,Eckert MA.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis[J].Oncotarget,2011,2(7):562-568.

[7]Pinho AV,Rooman I,Real FX.p53-dependent regulation of growth, epithelial mesenchymal transition and stemness in normal pancreatic epithelial cells[J].Cell Cycle,2011,10(8):1312-1321.

[8]Wallerand H,Robert G,Pasticier G,et al.The epithelial-mesenchymal transition inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/or metastatic bladder and prostate cancers[J].Urol Oncol,2010,28(5):473-479.

Effect of PDCD4 on apoptosis and tumorigenic capacity of SW579 thyroid cancer cells.

XIE Mao-yun,HUANG Yao, YANG Li-tao,WANG Xin-gen.Department of General Surgery,the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Uiniversity, Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA

Objective To study the mechanism of programmed cell death 4(PDCD4)-induced apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity in SW579 thyroid cancer(TC)cells.MethodsSW579 thyroid cancer cells in logarithmic growth phase were divided into two groups.Cells in the observation group were stimulated by PDCD4 apoptosis-related gene Bax for 14 hours and then by tPAfor collection.Cells in the control group did not received stimulation by Bax and tPA.AnnexinV/PI,API markers and Cyclins/DNA flow cytometry were used to check apoptosis and cycle specificity of SW579 cells.RT-PCR was applied to check the activation conditions of Caspase-3,Caspase-9.ResultsSW579 cells of peripheral blood in stationary phase were not sensitive to PDCD4 induction,while those in G1phase showed significant apoptosis under PDCD4 induction.PDCD4-induced apoptosis mainly occurred in the G1phase.The expression levels of Caspase-3,Caspase-9 mRNA in the observation group were(1.12±0.56),(1.10±0.29),which were significantly higher than those in the control group of(0.82±0.31),(0.72±0.26),P＜0.05.ConclusionPDCD4-induced apoptosis of SW579 cells is related to cell cycle,with cycle specificity of cell cycle arrest in G1phase.During the cell cycle arrest,Caspase activation occurred and is involved in the apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity.

Programmed cell death 4(PDCD4);SW579 thyroid cancer cell;Apoptosis;Cell cycle;Tumorigenic capacity

R736.1

A

1003—6350（2016）23—3790—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.003

2016-06-14)

广东省深圳市福田区公益性科研项目(编号：FTWS2014010)

谢茂云。E-mail：xiemaoyun@126.com