参芎葡萄糖注射液及其丹参组分对小鼠核受体表达的调控作用

吴琼，杨友辉，王文华，孙佳，薛维娜，何彬，龚菲，刘亭

(贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室1、医药卫生管理学院2、民族药与中药开发应用教育部工程研究中心3，贵州 贵阳 550004)

·论 著·

参芎葡萄糖注射液及其丹参组分对小鼠核受体表达的调控作用

吴琼1，杨友辉1，王文华1，孙佳1，薛维娜2，何彬3，龚菲3，刘亭1

(贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室1、医药卫生管理学院2、民族药与中药开发应用教育部工程研究中心3，贵州 贵阳 550004)

目的 考察参芎葡萄糖注射液(SGI)及其丹参组分(SM)对小鼠肝细胞中芳香烃受体(AhR)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)、孕烷X受体(PXR)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)mRNA表达的影响。方法采用随机数表法将40只雄性小鼠分为8组，每组5只，分别为空白组、阳性组(苯巴比妥)、SGI低剂量组(以丹参素计2.6 mg·kg-1·d-1)、SGI中剂量组(以丹参素计3.9 mg·kg-1·d-1)、SGI高剂量组(以丹参素计5.2 mg·kg-1·d-1)、SM低剂量组(以丹参素计2.6 mg·kg-1·d-1)、SM中剂量组(以丹参素计3.9 mg·kg-1·d-1)、SM高剂量组(以丹参素计5.2 mg·kg-1·d-1)，连续给药7 d。提取各组小鼠肝脏组织中的RNA，检测相关核受体mRNA的变化。结果与空白组相比，SGI高剂量组可以上调AhR mRNA的水平(P＜0.05)，上调倍数为1.7倍，但是SGI对PPARα、PXR、HNF-4α的mRNA水平没有显著性影响(P＞0.05)；SM对AhR、PPARα、PXR和HNF-4α的mRNA表达均无显著性影响(P＞0.05)。结论高剂量的参芎葡萄糖注射液能够影响AhR mRNA的表达，但这种影响并不是由其丹参组分导致的。

核受体；小鼠；荧光定量PCR；参芎葡萄糖注射液；丹参

细胞色素P450氧化酶(CYP450)是人体内最主要的药物氧化代谢酶，CYP酶在药物代谢过程中有着很重要的作用。大量的研究证实CYP被激活或被抑制是引起药物相互作用和导致药物不良反应增加或疗效降低的重要原因[1]。参芎葡萄糖注射液具有抗血小板聚集、降低血液黏度、改善微循环、抗心肌缺血和心肌梗死的作用，临床上主要用于闭塞性脑血管病及其他缺血性血管疾病等[2]。参芎葡萄糖注射液的药理作用广泛，与其他药物联用的机会也比较大，可能会发生药物之间的相互作用。课题组前期实验表明，参芎葡萄糖注射液及其丹参组分均能够引起CYP450的活性和表达的变化，但其具体机制尚不明确。核受体在CYP450的转录调控中起到了重要的作用，PPARα、HNF-4α、PXR和AhR是调控CYP450基因表达的主要的核受体，这些核受体的表达水平影响着药物代谢。因此，本实验将采用实时荧光定量PCR技术，检测参芎葡萄糖注射液及其丹参组分对小鼠肝组织中4种主要CYP450亚型的核受体mRNA水平的影响，从核受体表达调控，初步阐明参芎葡萄糖注射液及其丹参组分影响细胞色素P450氧化酶活性和表达的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级昆明种雄性小鼠40只，体质量22～25 g，由贵阳医学院实验动物房提供，动物合格证号：SCXK(黔)2012-0001。

1.2 药品与试剂 SGI(贵州景峰注射剂有限公司，批号H52020703)；SM(贵州景峰注射剂有限公司，批号20131006)；苯巴比妥(北京索莱宝科技有限公司，批号20150508)；Trizol(Invitrogen，批号79402)；Eastep总 RNA提取试剂盒(Promega，批号 20140801)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(大连宝生物有限公司，批号RR047A)；AhR、PPAR α、PXR、HNF-4α以及GAPDH的引物由上海生工生物公司合成；DEPC水(上海生工生物有限公司，批号LZ0223S14014L)；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(大连宝生物有限公司，批号RR820A)；50×TAE溶液(上海生工生物有限公司，批号B914KA1135)；4S Red Plus Nucleic(上海生工生物有限公司，批号AC29BC025)。

1.3 实验仪器 CFX96实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)；Biomate 3S核酸蛋白紫外测定仪(美国Thermo公司)；CQ-250A-ST超声波清洗器(上海跃进医用光学器械厂)；Thermo fresco 17高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；凝胶成像仪(基因有限公司)；恒温水浴锅(精宏)；电泳仪器(美国BIO-RAD公司)；EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；超低温冰箱(Thermo Fisher)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 实验小鼠随机分为8组，每组5只，分别给予生理盐水、苯巴比妥、SGI低剂量(以丹参素计2.6 mg·kg-1·d-1)、SGI中剂量(以丹参素计3.9 mg·kg-1·d-1)、SGI高剂量(以丹参素计5.2 mg·kg-1·d-1)、SM低剂量(以丹参素计2.6 mg·kg-1·d-1)、SM中剂量(以丹参素计3.9 mg·kg-1·d-1)、SM高剂量(以丹参素计5.2 mg·kg-1·d-1)，连续7 d给药。

1.4.2 总RNA的提取 末次给药禁食16 h，断颈处死，剪开腹腔取其肝脏，用预冷的生理盐水将肝脏的血冲洗干净。取大约20 mg的肝脏于已除RNA酶的手动玻璃匀浆器中，在冰上加入1 mL Trizol进行匀浆，把匀浆液倒入1.5 mL的离心管中，静置5 min；每1 mL Trizol中加入0.2 mL的氯仿，盖紧样品管盖，涡旋15 s，使其充分混匀，室温静置5 min，低温离心(12 000 r/min，15 min)；取上清400 μL，缓慢加入200 μL的无水乙醇，混匀，并按Eastep RNA提取试剂盒说明书，提取纯化肝脏总RNA。

1.4.3 RAN质量检测 取RNA样品10 μL加入DEPC水990 μL稀释100倍，用核酸蛋白紫外测定仪检测RNA样品260 nm、280 nm波长下的吸收度。根据A260值计算样品浓度，用A260/A280比值判断样品纯度。采用1.5%琼脂糖凝胶，1×TAE，恒压(5 V/cm)，电泳30 min，通过28S和18S条带灰度值比值来分析RNA样品的完整性。

1.4.4 逆转录反应 逆转录采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)试剂盒，在冰浴中调配混合试剂至离心管，逆转录反应体系见表1。将反应体系置于涡旋机涡旋混匀，低温离心约30 s，置于恒温水浴锅中：42℃15 min，85℃5 s，将合成好的cDNA保存在-20℃冰箱备用。

表1 逆转录反应体系

1.4.5 Real-time PCR反应 特异性引物序列见表2。荧光定量PCR反应使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂(TaKaRa)，在冰上配制荧光定量PCR反应体系20.0 μL见表3，加入到专用的八联PCR管。每个样品的目的基因进行3个重复反应孔，在CFX96荧光定量PCR仪上进行反应。反应参数：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40个循环。循环结束后绘制溶解曲线以及扩增曲线。每次扩增均设置GAPDH作为内参，分析并计算待测样本的循环数(Ct)，用2-△△Ct方法分析数据。

基因AhR HNF-4α PXR PPARα GAPDH序列号NM013464 NM008261 AF031814 X89577 M32599上游引物accagaactgtgagggttgg cggagcccctgcaaagt cccatcaacgtagaggagga ccatacaggagagcagggattt agtatgactccactcacggcaaat下游引物ctcccatcgtatagggagca ccagtctcacagcccattcc tctgaaaaaccccttgcatc ttacctacgctcagccctcttc gtctcgctcctggaagatggt

PCR反应体系cDNA SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×) PCR Forward Primer(20µmol/L) PCR Reverse Primer(20µmol/L) ddH2O共计体积(μL) 2.0 10.0 0.4 0.4 7.2 20.0

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 提取总RNA的质量检测 所提取的RNA条带清晰，28S条带的灰度值约为18S条带的2倍左右；RNA的纯度可用紫外分光光度计检测，提取的总RNA的A260/A280值在1.8～2.1之间，证明所提的总RNA纯度高、污染低，说明提取的RNA纯度满足实验要求。

2.2 SGI及SM对AhR、HNF-4α、PXR和PPARα mRNA水平的影响 利用实时荧光定量PCR技术考察了SGI和SM对小鼠肝脏4种核受体mRNA水平的影响，数据见表4和表5。结果表明，苯巴比妥组可以上调小鼠的AhR、PXR、HNF-4α、PPARα的mRNA的水平(P＜0.05)；SGI高剂量组AhR的mRNA水平为空白组的1.73倍(P＜0.05)；与空白组比较，SGI对小鼠的PXR、PPARα、HNF-4α的mRNA水平没有显著影响(P＞0.05)，SM对小鼠的AhR、PXR、HNF-4α、PPARα的mRNA水平也无显著性影响(P＞0.05)。

组别空白对照组苯巴比妥组S G I低剂量S G I中剂量S G I高剂量A h R m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 1 1 5 2 . 4 2 ± 0 . 2 3 1b0 . 8 ± 0 . 0 8 6 1 . 2 7 3 3 ± 0 . 1 3 8 1 . 7 2 6 7 ± 0 . 1 1 8aP P A R α m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 7 7 1 . 6 1 6 7 ± 0 . 0 9a1 . 3 0 6 7 ± 0 . 1 6 5 1 . 0 4 ± 0 . 0 8 0 . 7 1 ± 0 . 0 5 P X R m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 7 2 1 . 6 1 6 7 ± 0 . 0 9 9a0 . 8 4 ± 0 . 0 8 3 0 . 9 0 6 7 ± 0 . 0 6 3 1 . 1 0 6 7 ± 0 . 0 5 8 H N F -4 α m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 1 0 5 2 . 6 3 6 7 ± 0 . 0 9b1 . 2 7 3 3 ± 1 . 2 7 1 . 3 9 6 7 ± 1 . 3 9 1 . 3 9 3 3 ± 1 . 3 9注：与空白组比较，aP＜0 . 0 5，bP＜0 . 0 1。

表5 SM对小鼠肝核受体mRNA表达的影响(±s)

表5 SM对小鼠肝核受体mRNA表达的影响(±s)

注：与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别AhR mRNA PPARα mRNA PXR mRNA HNF-4α mRNA空白对照组苯巴比妥组SM低剂量SM中剂量SM高剂量1.000±0.105 2.066±0.145a1.506±0.069 1.483±0.084 1.302±0.070 1.000±0.077 1.466±0.09 1.32±0.065 1.142±0.049 0.85±0.33 1.000±0.056 1.315±0.055 0.903±0.063 0.972±0.076 1.04±0.058 1.000±0.085 2.136 7±0.32b1.093±0.09 1.05±0.106 1.066±0.144

3 讨 论

细胞色素P450酶多表达于肝脏，其中CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4以及CYP2D6是肝内最主要的P450亚型，负责代谢大多数的药物。研究表明，细胞色素P450 mRNA的表达与药物之间相互作用有密切相关，且小鼠体内存在与人基因同源或同功的基因，对小鼠进行研究，对人亦具有重要参考意义[3]。

核受体在外源性物质对转录水平的基因表达调控中起着重要的作用。近年来，研究人员对细胞色素P450酶的调控因子进行了广泛研究，发现大部分CYP1A、2B、2D、2E、3A等家族成员的表达受到核受体的调节[4]。AhR调控CYP1A家族的表达，HNF-4α主要调节CYP2D的水平；PXR主要激活CYP3A异构体；PPARα激活CYP2E亚型等[5]。在课题组前期研究中，已经发现参芎葡萄糖注射液对小鼠肝细胞色素P450酶的表达和活性有诱导作用。因此，本文进一步研究了参芎葡萄糖注射液及其丹参组分对主要亚型酶的核受体的影响，初步阐明参芎葡萄糖注射液对小鼠肝细胞色素P450酶表达的调控机制。给药7 d后，参芎葡萄糖注射液及其丹参组分对PXR、HNF-4α和PPAR α的表达没有显著性影响，但参芎葡萄糖注射液能够上调AHR的mRNA表达。

CYP1A2在前致癌物的代谢活化中发挥了重要作用，它的活性与许多药物的疗效或毒性密切相关，是引起代谢性药物相互作用的重要亚型。课题组前期研究发现，参芎葡萄糖注射液对小鼠肝脏中CYP1A2活性和表达有诱导作用。有文献报道，AhR主要调控CYP1A2的表达[5]。诱导剂与AhR相结合，形成复合物进入细胞核与转运因子结合成异二聚体，该异二聚体通过与CYP1A2启动子上游的特异性结合位点结合，从而调节CYP1A2的转录，改变CYP1A2的表达，起到诱导作用[6]。AhR水平的上调，通常能上调CYP1A2的表达。因此，我们推断，参芎葡萄糖注射液对小鼠肝脏中CYP1A2表达的诱导作用很可能与其上调AhR水平有关。

本实验结果表明，参芎葡萄糖注射液上调CYP1A2的基因表达的特性，很可能与其上调AhR转录水平相关。但是丹参组分并不能上调AhR mRNA水平，参芎葡萄糖注射液上调AhR表达很可能与其另一组分川芎嗪相关，这有待进一步的研究证实。

[1]Sinz M,Wallace G,Sahi J.Current industrial practices in assessing CYP450 enzyme induction:preclinical and clinical[J].AAPSJ,2008, 10(2):391-400.

[2]唐东晖.参芎胶囊联合银杏叶提取物治疗脑血管性痴呆的临床观察[J].现代中西医结合杂志,2013,22(23):2542-2543.

[3]Guo Y,Pope C,Cheng XG,et al.Dose-response of barbering on hepatic cytochromes P450 mRNA expression and activities in mice[J]. Journal of Ethno Pharmacology,2011,13(8):111-118.

[4]Ayed-Boussema I,Pascussi JM,Maurel P,et al.Effect of aflatoxin B1 on nuclear receptors PXR,CAR,AHR and their target cytochromes P450 mRNA expression in primary culturesof human hepatocytes[J].International Journal of Toxicology,2012,31(1):86-93.

[5]Wang YY,Yang J,Liu H,et al.Effects of tetrahydroxystilbene glucoside on mouse liver cytochrome P450 enzyme expressions[J].Xenobiotica,2015,45(4):279-285.

[6]张轶.冬凌草甲素对CYP450酶的影响及其机制研究[D].长沙:中南大学,2014.

Effects of Shenxiong Glucose Injection and the component of Salvia miltiorrhiza in regulation of nuclear receptor expression in mice liver.

WU Qiong1,YANG You-hui1,WANG Wen-hua1,SUN Jia1,XUE Wei-na2,HE Bin3,GONG Fei3, LIU Ting1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics1,School of Medicine and Health Management2, Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM3,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of Shenxiong Glucose Injection(SGI)and Salvia miltiorrhiza (SM)on the expressions of aryl hydrocarbon receptor(AhR),hepatic nuclear factor 4 alpha(HNF-4α),pregnane X receptor(PXR)and peroxisome proliferator activatedreceptor-α(PPARα)mRNA in mice livers.MethodsMice were divided into blank group,positive group（phenobarbital),SGI and SM different dosage groups of low-dose SGI group (2.6 mg·kg-1·d-1SM),medium-dose SGI group(3.9 mg·kg-1·d-1SM),high-dose SGI group(5.2 mg·kg-1·d-1SM) and low-dose SM group(2.6 mg·kg-1·d-1SM),medium-dose SM group(3.9 mgv·kg-1·d-1SM),high-dose SM group (5.2 mg·kg-1·d-1SM),according to the random number table.Then the mice were killed after being administered medicines once daily for consecutive 7 days.Livers were prepared to determine the expression levels of AhR,HNF-4α,PXR and PPARα mRNA by quantitative real-time PCR in mice.ResultsCompared with the blank group,AhR mRNA were increased by 1.7 times in the high-dose SGI group(P＜0.05).SGI was found to have no impact on the expressions of HNF-4α,PXR and PPARα mRNA(P＞0.05),and SM was found to have no impact on the expressions of AhR,HNF-4α, PXR and PPARα mRNA(P＞0.05).ConclusionSGI of high dose could upregulate the expression of AhR mRNA in mice livers,which is not contributed by SM.

Nuclear receptor;Mice;Real-time fluorescent quantitative PCR;Shenxiong Glucose Injection;Salvia miltiorrhiza

R-332

A

1003—6350（2016）23—3785—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.001

2016-05-12)

贵州省科学技术基金(编号：黔科合J字[2013]2034号)；贵州省卫生厅科学技术基金项目(编号：gzwkj2013-1-069)；2014年贵州省教育厅大学生创新创业重点项目(编号：201410660005)；贵州省中药现代化专项项目(编号：黔科合中药字[2013]5062号)

刘亭。E-mail:1586740@qq.com