鲍曼不动杆菌耐药性与噬菌体的相关性



鲍曼不动杆菌耐药性与噬菌体的相关性

周园王岚林鸿冯伟1刘新

(辽宁省环境污染与微生态实验室，辽宁沈阳110034)

〔关键词〕噬菌体；鲍曼不动杆菌；耐药性

1沈阳市第四人民医院重症医学科

第一作者：周园(1967-)，女，高级讲师，硕士，主要从事微生态学及微生物学研究。

关于Ab形态结构与耐药性关系鲜有报告，噬菌体是感染细菌的病毒，具有溶原性和裂解性两种生长方式〔1〕，根据与宿主菌的相互关系，分为温和噬菌体、毒性噬菌体两种类型。过去人们关注毒性噬菌体裂解宿主菌，期待发挥治疗性应用，但长期研究并未取得实质性进展〔2〕。鲍曼不动杆菌(Ab)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛分布于外环境中，它黏附力极强，是引起医院内感染的重要条件致病菌之一，在住院病人尤其是重症监护病房(ICU)的老年患者中可引起致命性感染。关于Ab形态结构与耐药性关系鲜有报告。本研究对ICU 60岁及以上感染患者分离的Ab菌株进行耐药性分析及细菌超微结构观察，探讨耐药菌引起医院感染的机制。

1材料和方法

1.1标本采集标本来自沈阳市第四人民医院ICU病房，包括患者痰、呼吸机导管及手术的引流管等，临检判定为Ab，经LB肉汤培养基增菌，然后转种于青霉素·诺氟沙星培养基上培养。单个菌落经中国蓝培养基，44℃连续传代纯化，生化反应测定符合不动杆菌属，细菌鉴定仪鉴定到种。将经过鉴定的菌株通过肉汤培养基增菌24 h，比浊法调细菌的密度为1×108/ml，备用。

1.2试剂与仪器营养琼脂培养基，中国蓝培养基，M-H培养基(北京奥博星生物技术有限公司)，革兰阴性杆菌鉴定试剂条(REF 32100 梅里埃公司)，药敏纸片(OXOID 公司)： 哌拉西林(PIP)、 头孢曲松(CRO)、 头孢他啶(CAZ)、 头孢噻肟(CTX)、 头孢吡肟(FEP)、 亚胺培南(IPM )、美洛培南(MEM)、 氨曲南(AZT)、 头孢哌酮舒巴坦(CSL)、 替卡西林 /克拉维酸(TCC)、 哌拉西林/他唑巴坦(TZP)。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922、 铜绿假单胞菌ATCC27853，Ab标准株：ATCC 19606(宝特生物公司代购)，本室保存传代。自动化细菌鉴定仪(ATB，法国生物梅里埃公司)，S-4800冷场发射扫描电镜(日立公司北京办事处)。

1.3菌种鉴定标本直接涂片，革兰染色；氧化酶、触酶、硝酸盐还原试验及动力试验。ATB鉴定，操作步骤严格按照说明书进行。

1.4药敏试验采用K-B 纸片扩散法,判定标准按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2012版执行〔3〕。

1.5扫描电镜标本制备将具有泛耐药的菌株以1 200 r/min,离心2 min，得到细菌集团，取少量转入盛有预冷的2.5 %戊二醛固定剂eppendorf管中固定，4℃过夜。4℃条件下0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗 15 min ×3次，1%锇酸固定液固定2 h，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min ×3次，脱水：50%乙醇15~20 min ，70%乙醇15~20 min ，90%乙醇15~20 min，90%乙醇90%丙酮(1∶1)15~20 min，90%丙酮15~20 min。固化：37℃过夜。镀膜20S。S-4800冷场发射扫描电镜观察。

2结果

2.1药敏试验见表1。Ab为革兰阴性球杆菌，多成对排列；无芽胞、无鞭毛，较难脱色，氧化酶、硝酸盐还原动力试验阴性。

表1　45株Ab对抗生素的药敏试验〔n(%)〕

2.2耐药Ab超微结构观察经呼吸机导管分离的耐药Ab表面可见数个噬菌体附着，噬菌体头部呈多边形，噬菌体头部直径小于200 nm，菌体形态保持球杆状；菌体球杆状，表面光滑，无细胞壁破裂；菌毛附着于菌体：短而直、中空管状,末端有多处分枝；菌体间可见分枝的菌毛呈多向接合。未见尾丝结构，菌体完整无破损，非耐药Ab对照株菌体表面光滑，未见噬菌体吸附；耐药株菌体尚可见中空管状的性菌毛及多向接合(图1)。

图1　Ab扫描电镜图片

3讨论

目前报告Ab的耐药机制比较复杂，包括耐药酶或称药物灭活酶的产生；外膜蛋白的减少、缺失或突变；药物外排泵的形成；药物作用靶位：青霉素结合蛋白(PBPs)表达减低或缺乏及可移动遗传元件参与的耐药基因的传递等。噬菌体在自然界广泛分布，凡是有细菌的场所，就有相应噬菌体的存在。噬菌体的形态结构一般分成三种类型：即无尾部结构的二十面体，有尾部结构的二十面体和线状体〔4〕。本试验中观察到Ab耐药株的噬菌体为多边形，未见尾丝结构，故应属无尾部结构的二十面体噬菌体，本室保存的Ab标准菌株ATCC19606，为细菌生物被膜模式株〔5〕，未见噬菌体存在，药敏试验表明对多种抗生素敏感，提示耐药菌株上的温和噬菌体可能与其耐药有关。

温和噬菌体是指噬菌体感染细菌后，并不裂解宿主菌引起死亡，关于温和噬菌体与不动杆菌溶原性及与耐药相关性目前未见有报道。本研究说明宿主菌处于溶原状态，如果噬菌体将其自身的基因组整合于宿主菌中的染色体中，这种整合意味着宿主菌基因组变化，是否因此导致耐药性有待于进一步研究。

另外，本研究在电镜下还观察到Ab存在性菌毛多重接合现象，值得加以关注。呈分枝状的性菌毛，使接合的机会更多，这种现象未见有文献报道。因为性菌毛能在细菌之间传递DNA，是细菌产生耐药性的原因之一，本研究结果提示溶原性细菌可能通过噬菌体启动耐药基因，而由性菌毛多重接合，将耐药基因广泛传递使细菌快速产生了耐药性，因此深入研究噬菌体在细菌耐药性产生过程中的作用机制有望在预防和治疗老年患者细菌感染方面提供新的思路。

4参考文献

1李凡,涂志凯.医学微生物学 〔M〕.第7版. 北京：人民卫生出版社，2008：43-5.

2梁莉，杨洪江，金鑫.鲍曼不动杆菌烈性噬菌体的分离与纯化〔J〕.生物学杂志，2010;27(4)：88-90,93.

3孙长贵，成军，杨燕.2012年CLSI M100-S22文件主要更新内容的解〔J〕.中华检验医学杂志，2012;35(8)：676-8.

4闻玉梅.精编现代医学微生物学〔M〕.上海： 复旦大学出版社，2002：61-2.

5Gaddy JA，Tomaras AP,Actis LA. The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells〔J〕.Infect Immu,2009;77(8):3150-60.

〔2014-06-09修回〕

(编辑张慧)

通讯作者：刘新(1961-)，女，教授，硕士，硕士生导师，主要从事医院感染研究。

基金项目：沈阳医学院科学研究基金项目(20111029)

〔中图分类号〕Q939.48

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0709-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.088

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