老年非小细胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白与p-AKT的表达及意义

杨大运　邢亚威　张月花　齐　战

(河北医科大学第四医院内科，河北　石家庄　050011)



老年非小细胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白与p-AKT的表达及意义

杨大运邢亚威张月花齐战1

(河北医科大学第四医院内科，河北石家庄050011)

〔摘要〕目的探讨Raf激酶抑制蛋白(RKIP)及p-AKT在老年非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及意义。方法对RKIP和p-AKT的蛋白进行间接免疫荧光标记，采用流式细胞仪对78例NSCLC及相应癌旁正常肺组织进行定量检测。结果RKIP在 NSCLC组织中的表达量明显低于癌旁正常肺组织(P<0.05)；p-AKT在NSCLC组织中的表达量明显高于癌旁正常肺组织(P<0.05)；RKIP、p-AKT的表达量均与肺癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存期有关(P<0.05)。结论在肺癌发生中RKIP表达减少，p-AKT表达上调，可能是导致NSCLC发生、发展的原因，可作为NSCLC恶性程度及预后判断的指标。

〔关键词〕非小细胞肺癌；流式细胞术；Raf激酶抑制蛋白；p-AKT

1河北医科大学第四医院胸外科

第一作者：杨大运(1973-)，女，副主任医师，博士，主要从事肺癌的侵袭转移研究。

以非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%，肿瘤的复发、转移是NSCLC患者死亡的主要原因。 Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族成员，是近年来新发现的一种肿瘤转移抑制因子，具有抗肿瘤侵袭转移的作用〔1〕。AKT是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是原癌基因之一〔2〕。磷酸化的AKT(p-AKT)是其活化形式，它参与多种肿瘤的形成。本研究应用流式细胞术检测RKIP和p-AKT在NSCLC及正常肺组织中的表达情况，探讨两者与NSCLC患者临床病理特征的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选择2011年1~12月我院病理科确诊为NSCLC的手术标本78例，对照组为相应癌旁正常肺组织(距肿瘤边缘5 cm以上)。年龄60~75岁，平均年龄65.5岁；其中男46例，女32例；吸烟者44例，非吸烟者34例；鳞癌43例，腺癌35例；肺癌分期采用2009年IASLC/UICC公布的第7版TNM分期标准，Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲa+Ⅲb期30例；有淋巴结转移者38例，无淋巴结转移者40例。所有标本均由病理学教授进行HE染色切片，明确病理诊断。患者术前均未行放疗或化疗。兔抗人RKIP多抗、兔抗人p-AKT多抗均为美国Santa Cruz公司产品。 FITC标记的羊抗兔IgG二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.2流式细胞检测(FCM)

1.2.1样品的制备切取组织块，网搓法制备细胞浓度为1×106/ml的单细胞悬液。

1.2.2间接免疫荧光法标记取0.1 ml单细胞悬液，分别加入1∶100稀释的RKIP兔抗人多克隆抗体和兔抗人p-AKT多克隆抗体工作液各0.1 ml。室温孵育30 min，加入PBS洗涤后，弃上清，加入1∶50稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG二抗工作液0.1 ml。避光室温孵育30 min，PBS洗涤，离心，弃上清除去未结合的荧光抗体，将细胞重新悬浮于1 ml PBS中，过滤后流式细胞仪检测。每次检测除以同一患者正常肺组织作为正常对照外，还设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的阳性对照和同型对照。

1.2.3流式资料分析方法按Morkve等〔3〕提出的分析方法，以荧光指数(FI)表示它们的相对含量，公式为：FI=(样品基因蛋白表达的平均荧光强度-阴性对照的平均荧光强度)/阴性对照的平均荧光强度。FI>1.0为RKIP或p-AKT阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

1.3统计学分析应用SAS13.00软件行t检验和One-Way ANOVA。

2结果

2.1RKIP、p-AKT在NSCLC与正常肺组织中的表达在NSCLC与正常肺组织中，RKIP的表达量分别为1.563±0.132和1.114±0.107，二者差异显著(t=18.380，P<0.05)；p-AKT的表达量分别为1.113± 0.125和1.529±0.124，二者差异显著(t=19.260，P<0.05) 。

2.2RKIP、p-AKT的表达与NSCLC临床病理特征的关系RKIP、p-AKT均与NSCLC的临床分期、肿瘤的分化程度、生存期及淋巴结转移有关(P<0.05)，而与性别、吸烟史、肿瘤大小以及病理类型无关(P>0.05)。见表1。

表1　肺癌组织中RKIP的表达与NSCLC临床病理特征的关系±s)

3讨论

RKIP是一种高度保守、广泛表达的小分子胞质蛋白，参与细胞凋亡、神经发育以及精子发生等病理生理过程。目前研究发现，RKIP具有抑制肿瘤转移的功能，是一种肿瘤转移抑制基因，它参与细胞内ERK/MAPK、NF-κB等信号通路的调控〔4〕，通过上调E-cadherin和下调MMPs的表达，抑制上皮-间叶转变，降低对细胞外基质和基底膜的破坏，进而发挥其抗侵袭、转移的功能〔5,6〕。多项研究显示，RKIP在结直肠癌〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕等多种肿瘤组织中表达下调，本结果显示，NSCLC中RKIP的表达量明显低于正常肺组织，其表达量与肺癌的分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移以及生存时间有关。表明RKIP表达量减少在NSCLC的发生及侵袭转移过程中发挥重要作用。

研究发现，p-AKT在鳞状上皮化生和不典型增生组织中高度活化，远高于肺癌组织，正常的支气管上皮组织中表达较少或缺失，说明p-AKT参与了癌变的早期阶段〔10〕。研究发现，p-AKT在多种肿瘤组织中过度表达〔11~14〕。关于p-AKT的表达对于NSCLC侵袭转移及预后的意义，仍然存在着争议，更多的研究倾向于p-AKT过度活化预示NSCLC预后较差。本实验结果显示，NSCLC中p-AKT的表达量明显高于正常肺组织，其表达量与肺癌的分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移以及生存时间有关，表明原癌基因AKT参与了NSCLC的发生发展，p-AKT表达量增加在NSCLC的发生及侵袭转移过程中发挥重要的作用。

4参考文献

1Escara-Wilke J,Yeung K,Keller ET.Raf kinase inhibitor protein (RKIP) in cancer〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2012;31(3-4):615-20.

2Flatley E,Ang D,Warrick A,etal.PIK3CA-AKT pathway mutations in micropapillary breast carcinoma〔J〕.Hum Pathol,2013;44(7):1320-7.

3Morkve O,Laerum OD.Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin-embedded tissue from bronchial carcinomas〔J〕.Cytometry,1991;12(5):438-44.

4Lee SJ,Lee SH,Yoon MH,etal.A new p53 target gene,RKIP,is essential for DNA damage-induced cellular senescence and suppression of ERK activation〔J〕.Neoplasia,2013;15(7):727-37.

5Zhao D,Ma J,Shi J,etal.Raf kinase inhibitor protein inhibits esophageal cancer cell invasion through downregulation of matrix metalloproteinase expression〔J〕.Oncol Rep,2013;30(1):304-12.

6Zhu C,Wang Q,Xie J,etal.Expression and significance of RKIP and E-cadherin in lung squamous cell carcinoma〔J〕.Pathol Oncol Res,2013;19(1):19-26.

7Koelzer VH,Karamitopoulou E,Dawson H,etal.Geographic analysis of RKIP expression and its clinical relevance in colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer,2013;108(10):2088-96.

8Martinho O,Simões K,Longatto-Filho A,etal.Absence of RKIP expression is an independent prognostic biomarker for gastric cancer patients〔J〕.Oncol Rep,2013;29(2):690-6.

9Poma P,Labbozzetta M,Vivona N,etal.Analysis of possible mechanisms accounting for raf-1 kinase inhibitor protein downregulation in hepatocellular carcinoma〔J〕.OMICS,2012;16(11):579-88.

10Tsao AS,McDonnell T,Lam S,etal.Increased phospho-AKT (Ser473) expression in bronchial dysplasia:implications for lung cancer prevention studies〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003;12(7):660-4.

11Kunter I,Erdal E,Nart D,etal.Active form of AKT controls cell proliferation and response to apoptosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Oncol Rep,2014;31(2):573-80.

12Park YH,Jung HH,Ahn JS,etal.Statin induces inhibition of triple negative breast cancer (TNBC) cells via PI3K pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;20;439(2):275-9.

13Nijkamp MM,Span PN,Stegeman H,etal.Low phosphorylated AKT expression in laryngeal cancer:indications for a higher metastatic risk〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2013;87(2):349-55.

14Chetram MA,Bethea DA,Odero-Marah VA,etal.ROS-mediated activation of AKT induces apoptosis via pVHL in prostate cancer cells〔J〕.Mol Cell Biochem,2013;376(1-2):63-71.

〔2014-08-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：齐战(1971-)，男，主任医师，博士，主要从事肺癌以及食管癌的侵袭转移研究。

〔中图分类号〕R734.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0644-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.058