条件性味觉厌恶学习对大鼠舌乳头上皮leptin的表达及上皮细胞超微结构的影响

李海艳　李宝群　耿丹丹　程振宇

(承德医学院人体解剖教研室，河北　承德　067000)



条件性味觉厌恶学习对大鼠舌乳头上皮leptin的表达及上皮细胞超微结构的影响

李海艳李宝群耿丹丹1程振宇

(承德医学院人体解剖教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的制备条件性味觉厌恶学习大鼠模型，观察味觉厌恶学习(CTA)对舌乳头上皮瘦素(leptin)表达的影响和超微结构变化的影响。方法SD大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪上，于顶部切开皮肤，深达顶骨。经皮肤切口处经耳、眼间皮下组织导入聚乙烯管经颊部穿入口腔，在顶骨表面打孔、上螺丝钉，用以固定导管，将味溶液经导管注入口腔。术后3~5 d，经导管向口腔内注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，再腹腔注0.15 mol/L LiCl，建立味觉厌恶学习模型。灌流固定后取舌，采用免疫组化技术和电镜方法来观察舌乳头上皮的情况。结果①leptin的阳性表达出现在舌乳头上皮内，且CTA组舌乳头上皮的表达明显高于对照组。②实验组线粒体数目明显减少，并出现水肿，嵴断裂；细胞核不规则，核膜凹陷或形成核袋；细胞镶嵌连接的缝隙变小；可见溶酶体。结论建立CTA动物模型后，表现为对甜味的明显厌恶，CTA可影响leptin在舌乳头上皮中的表达。而且一些细胞器形态异常，可能是动物自身的一种应激反应或保护机制。

〔关键词〕味觉厌恶学习；瘦素；舌乳头上皮

1河北医科大学人体解剖教研室

第一作者：李海艳(1979-)，女，讲师，硕士，主要从事动物形态与生理研究。

动物摄取某种新异的味觉刺激后，若出现恶心、呕吐、腹泻等内脏不适，动物便可“记住”这种食物的味觉特征，减少或拒绝摄取具有相同味觉特征的食物，这种行为变化过程称为条件性味觉厌恶学习(CTA)，是动物避免重复摄取有毒食物的一种重要学习机制。味觉对于调节摄食，控制体重起着重要的作用。其中由脂肪细胞产生的瘦素(leptin)能够调整食物的吸收，能量的消耗和体重。目前认为味觉器官是leptin作用于外周的靶器官之一，leptin抑制对甜味物质的行为是通过作用于味觉细胞的ob-Rb受体，降低味觉感受器的敏感性。因此由leptin引起的味觉调整可能参与对食物吸收的调整〔1〕。本研究通过建立大鼠CTA模型，探讨大鼠的学习记忆活动与leptin蛋白的关系。

1材料与方法

1.1动物及主要试剂成年雄性清洁级SD大鼠28只，体重250～300 g，购于河北医科大学实验动物中心〔许可证号：SCXK(冀)2008-1-003〕。购入后分笼饲养5～7 d，自由摄食和饮水，每日予以抚摩。随机分为两组：CTA组和对照组，每组14只。其中每组用来做免疫组织化学检测10只，做电镜检测4只。leptin兔多克隆抗体干粉(PR-0205，北京中杉金桥生物技术有限公司)，用前PBS溶解，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，二氨基联苯胺(DAB，Sigma公司)，戊巴比妥钠，LiCl，水合氯醛等。

1.2口腔插管手术大鼠适应饲养后，腹腔注射0.5%戊巴比妥钠(45 mg/kg体重)麻醉，固定于脑立体定位仪上，手术暴露顶骨。将医用单孔聚乙烯管的一端，由皮肤切口处经耳眼间皮下组织导入大鼠颊部并穿入口腔，在口腔内加一垫圈固定，在顶骨表面固定两螺丝钉，将导管上端用牙托粉固定于螺丝钉上，伤口处洒上灭菌结晶磺胺消炎。

1.3CTA模型的建立口腔插管手术后3~5 d，经口腔插管向口腔内注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，5 min内注完。20 min后，腹腔注0.15 mol/L的LiCl (20 ml/kg体重)，禁食禁水12 h后，用两瓶法测定水和蔗糖的摄取量。如果对蔗糖的摄取量<0.5 ml，则说明建立了1次CTA。重复建立3次予以巩固。

1.4免疫组织化学显色造模成功后，腹腔内注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg体重)麻醉，打开胸腔暴露心脏，经升主动脉插管，150 ml生理盐水灌流冲洗，麻醉后用4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L PB，pH7.4)，灌流固定1.5 h，取舌，一部分置于4%多聚甲醛固定用于光镜观察，另一部分用戊二醛固定用于电镜观察。用于光镜观察的经常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，每隔3片取1片。采用SP免疫组织化学显示法测定大鼠舌的leptin表达水平。leptin兔多克隆抗体稀释浓度为1∶300，DAB染色，苏木素复染。阴性对照以PBS代替一抗进行免疫组织化学染色，其他步骤相同。在光学显微镜下观察免疫阳性产物的分布，应用Nikon显微镜Image-Pro Plus(IPP)分析软件测量阳性产物的厚度。每只大鼠观察6张切片，每张切片在200倍显微镜下取6个视野，单位面积内leptin阳性细胞数(个/mm2)，取平均值作为该舌乳头上皮leptin蛋白表达的相对水平。

1.5电镜观察切取两组舌，切成约1 mm3的小块，快速放入3.1%戊二醛固定2 h，1%OSO4后固定1 h，丙酮梯度脱水，常规电镜包埋，半薄切片，光镜下选区、定位，超薄切片，铀-铅双染。透射电镜下观察上皮细胞的超微结构并照相。

1.6统计学方法采用SPSS14.0软件行t检验。

2结果

2.1leptin阳性表达比较leptin阳性产为位于细胞质，呈棕黄色，广泛分布在丝状乳头、菌状乳头以及轮廓乳头上皮。CTA组与舌乳头的上皮染色明显加深；对照组丝状乳头和菌状乳头阳性上皮leptin的表达均比CTA组明显降低(P<0.01)(图1)。

2.2舌上皮细胞的超微结构改变对照组相邻上皮细胞侧面，质膜相互凹凸相嵌，形成镶嵌连接。细胞核大，较规则，有明显的核仁，异染色质少，常染色质丰富。粗面内质网少，核糖体丰富，可见桥粒。核膜清晰，可见双层，异染色质多，相邻细胞膜形成镶嵌连接。线粒体量较多，嵴清晰。粗面内质网较少，核糖体丰富，见图2。CTA组舌上皮细胞之间的镶嵌连接的缝隙明显变小，桥粒较丰富，多数细胞核较规则，可见核仁。细胞核可见核袋，异染色质较少，常染色质丰富。有的染色体肿胀、嵴断裂，有的染色体致密、嵴模糊。粗面内质网少见，核糖体丰富，可见溶酶体。细胞核不规则，核膜凹陷或形成核袋。异染色质较多，边集在核膜表面。线粒体水肿，部分嵴断裂或形成絮状结构。核糖体丰富，粗面内质网少见，见图3。

对照组丝状乳头

CTA组丝状乳头

对照组菌状乳头

CTA组菌状乳头

图2　对照组舌上皮细胞的超微结构

图3　CTA组舌上皮细胞的超微结构

3讨论

leptin主要在脂肪组织中表达，它被认为是一种饱食信号，主要是调节能量平衡和控制体重。给遗传性肥胖小鼠(ob小鼠)的脑脊液注入瘦素后，进食量明显减少，体质量也逐渐下降到正常水平〔2〕。Monteleone等〔3〕和Waelput等〔4〕发现leptin具有广泛的生物学效应：一是通过与下丘脑的瘦素受体结合，它主要是抑制下丘脑弓状核的表达和分泌神经肽Y等多种神经内分泌激素的分泌，从而降低食欲，减少食物的摄入和减轻体重；二是作用于其他外周组织(包括肝脏、脾、肺、肾、心、胰腺)的瘦素受体，其中脑内表达较高〔5〕。动物建立味觉厌恶学习后，有恶心、呕吐、腹泻等内脏不适的表现，对摄食的适应性调节能力降低，进而导致胃排空的延迟。而leptin水平及其受体表达的多少和性状的改变，可以改变胃的顺应性，抑制摄食，延迟胃排空。原因是leptin直接激活迷走神经传入神经元，通过迷走神经到达孤束核(NTS)刺激leptin敏感神经元，再抑制胃运动和排空〔6〕。敲除leptin受体基因的db/db小鼠，依然能建立条件性味觉厌恶学习，但是却加快了CTA的消退过程。这种现象的出现可能是因为leptin受体广泛分布在CTA相关的脑区〔7〕。此外在CTA形成和保持中，leptin受体的活性或功能发生变化，表明leptin在味觉和内脏信息的相互作用中具有重要的作用〔8〕。但是动物建立CTA后是否会影响leptin的表达，目前尚未见到报道。

同时也有人通过半定量RT-PCR分析显示ob-Rb受体在菌状乳头和轮廓乳头的味蕾中有表达，但在周围的上皮组织中表达的不是很清楚。在这3种不同组织中的表达，部分与味觉特异性G蛋白、alpha-gustducion很相似。其他的Ob-R在其他的味觉乳头或者上皮组织都有广泛的分布〔9，10〕。本研究结果提示瘦素在味觉厌恶学习中发挥一定的作用，可能参与了大鼠的学习记忆活动，充实了CTA理论。

目前有关建立CTA后对细胞器的影响报道较少。线粒体是真核生物能量和代谢的中心。目前已认识到线粒体是细胞凋亡的“中心执行者。本实验提示细胞之间的通透性变差，以减少对甜味物质的吸收，CTA组可见溶酶体，可能是大鼠建立CTA后，舌上皮出现水肿，细胞有坏死的情况。总之，通过实验可以看出，动物建立CTA这一涉及厌恶情绪的模型后，导致了一些细胞器形态结构异常，可能是动物自身的一种应激反应或保护机制，探究其原因，还需要进一步的研究。

4参考文献

1Shigemura N，Ohta R，Kusakabe Y，etal.Leptin modulates behavioral responses to sweet substances by influencing peripheral taste structures〔J〕.Endocrinology，2004；145：839-47.

2王田. 瘦素的研究进展〔J〕.现代中西医结合杂志，2009；18(28)：3525-6.

3Monteleone P，Maj M, Dilieto A，etal. Leptin functioning in eating disorders〔J〕. CNS Spectrums, 2004；9(7)：523-9.

4Waelput W，Brouckaert P，Broekaert D，etal. A role for leptin in the systemic inflammatory response syndrome(SIRS) and in immune response 〔J〕. Inflamm Allergy，2002；1(3)：277-89.

5王丽红，陈诺琦. 瘦素的生物学效应及与糖尿病的联系〔J〕. 中国实用医药，2010；5(19)：239-41.

6于卫星，魏良洲. 瘦素与胃排空〔J〕. 国际消化病杂志，2007；27(6)：428-30.

7Ohta R，Shigemura N. Conditioned taste acersion learning in leptin-receptor-deficient db/db mice〔J〕. Neurobiol Lear Mem，2003；80(2)：105-12.

8韩蓁，闫剑群，宋新爱，等. 瘦素受体在条件性厌味大鼠脑的表达〔J〕. 第四军医大学学报，2003；24(1)：11-3.

9李海艳，陈萌，孙祥玉.瘦素及其受体与消化系统关系的研究进展〔J〕.承德医学院学报，2012；29(2)：187-9.

10唐美岸，何振华，张秀蜂. 苦参碱对肺纤维化大鼠肺线粒体氧化应激的影响〔J〕. 广东医学，2012；33(2)：182-5.

〔2014-08-19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R338

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0564-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.021