口腔鳞状细胞癌患者唾液的代谢组学分析

及　昕　崔磊华　张　宁　韩明林　韩成敏

(吉林大学口腔医学院，吉林　长春　130021)



口腔鳞状细胞癌患者唾液的代谢组学分析

及昕崔磊华张宁韩明林韩成敏

(吉林大学口腔医学院，吉林长春130021)

〔摘要〕目的利用基于液相-质谱联用的代谢组学研究方法寻找口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者唾液中潜在的生物标志物。方法采用高分离度快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(RRLC/Q-TOF/MS)技术对OSCC患者和健康人的唾液样品进行分析，分别获得两组样品的代谢轮廓，同时运用主成分分析法(PCA)技术对两组代谢物进行分类，并寻找潜在的生物标志物。 结果RRLC/Q-TOF/MS检测结果显示，OSCC组和健康组人群唾液代谢轮廓存在明显的差异，发现并鉴定得到了7个OSCC相关的生物标志物，分别为胆碱、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉毒碱，与正常健康人相比，胆碱的代谢趋势上调，其余代谢物的趋势均下调。 结论与健康人相比，OSCC患者主要存在着氨基酸代谢和能量代谢失衡的现象，同时三羧酸循环代谢异常，为将来的临床诊断和治疗提供了重要的信息。

〔关键词〕口腔鳞状细胞癌;唾液;高分离度快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱;代谢组学

第一作者：及昕(1968-)，女，主管护师，主要从事口腔护理临床研究。

WHO报道，从确定上皮源性的鳞状细胞癌(OSCC)诊断开始，口腔癌患者的五年存活率为55%左右〔1〕。有报道指出,早期诊断OSCC可以使其五年成活率达到80%~90%〔2〕。近年来，通过代谢组学的方法寻找患者的特异性生物标志物来诊断疾病已经受到越来越多学者的关注。可以用以检测的生物体液通常包括血液、尿液、唾液等。其中唾液具有收集简单方便，无痛等优点〔3〕，本研究通过高分离度快速液相色谱与四级杆-飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF-MS)联用的技术对健康人及临床已经诊断为OSCC患者的唾液进行了代谢轮廓研究，旨在寻找潜在的生物标志物。

1材料与方法

1.1实验材料Agilent 1200 型RRLC系统，Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪(美国Agilent公司)，配有ESI 离子源及Mass Hunter 数据处理系统和Mass Profile Professional(MPP)统计软件(安捷伦公司)。甲醇、甲酸、乙腈(色谱纯，美国 Tedia 公司)，实验用水由 Milli-Q 超纯水系统制备。

1.2实验方法

1.2.1样品采集临床样品采自吉林大学口腔医院口腔颌面外科，包括16例OSCC患者(男12例，女8例)，年龄45～63岁〔平均(54.9 ±5.5)〕岁，所有患者均征得患者本人同意，并由入院前行病理切片检查确定病情后，分别在手术前(未行化疗药物治疗)行唾液样品采集。 以16例正常人(男12例和女8例)，年龄42～60岁，平均(51.0±7.2)岁，设为空白对照组。采集前确保受试者的口腔黏膜、牙龈无出血、溃疡等病变，术前不少于1 h患者无进食、饮水、吸烟。以吐口水的方式收集唾液3 ml于离心管中，其中离心管处于充满碎冰的杯子中，同时提醒患者不要咳出痰液。

1.2.2样品处理方法取200 μl唾液中加入200 μl甲醇/乙腈(1∶1，v/v)溶液，涡旋15 s充分混匀溶液，4℃条件下10 000 r/min离心10 min，取上清液-80℃保存。

1.2.3色谱-质谱条件

1.2.3.1色谱条件Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm，3.5 μm)；流动相A为超纯水溶液(0.1%甲酸)，流动相B为乙腈；流动相洗脱程序为0～5 min，10%～20% B;5～7 min，20%～30% B;7～12 min，30%～80% B;12～14 min，80%～85%B;14～17 min，85%～95%B;17～22 min，95%～100%B。柱温30℃，流速：0.3 ml/min，进样量10 μl。

1.2.3.2MS条件采用电喷雾正离子模式(ESI+)；干燥气温度：300℃；质量扫描范围50~1 000 m/z；干燥气流速9 L/min，喷雾气压 40 psig；毛细管电压 3.5 kV。

1.4数据处理经预处理后的唾液样品运用RRLC-MS进行检测，实验数据经Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)数据处理软件进行分子特征识别，之后将所得数据导入MPP统计软件中进行滤噪和归一化处理，并进行主成分分析。

2结果

2.1OSCC患者与健康人唾液质谱数据分析图1为正常人和OSCC患者唾液典型的总离子流色谱图，可以观察到两者的总离子流图存在着明显的差异。经MPP软件进行峰的提取和匹配后，在唾液中共识别出了116个代谢物的离子信息。为了将健康人和OSCC患者进行区分，对所收集的唾液样品的实验数据进行了主成分分析(PCA)，见图2和图3，两者在得分图中实现了明显的区分，这说明OSCC患者与健康人相比唾液中的代谢物谱发生着明显的变化。

图1　唾液样品的典型总离子流图

2.2差异代谢物鉴定结果进一步比较OSCC组和健康对照组两者之间唾液中的代谢差异，依据精确质量数、二级质谱(MS2)信息及NIST 、HMDB、METLIN、KEGG 等数据库信息进行结构鉴定，最后用标准品对其中几个鉴定结果进行验证。鉴定出了7种生物标志物，分别是色氨酸、苯丙氨酸 、葡萄糖、谷氨酸、肉毒碱、谷氨酰胺、胆碱,鉴定结果及变化趋势见表1，除胆碱OSCC组与健康组倍数变化趋势为升高外，其余6种标志物趋势均下调。

(■：OSCC组，▲：健康对照组)图2　OSCC患者和健康组唾液的PCA二维得分图

(■：OSCC组，▲：健康对照组)图3　OSCC患者和健康组唾液的PCA-3D得分图

代谢物质量(m/z)P值OSCC组vs健康组(倍数)代谢途径色氨酸204.08994.52×10-21.47氨基酸代谢肉毒碱161.10524.83×10-21.53脂肪酸β-氧化谷氨酰胺146.06912.13×10-31.31氨基酸代谢苯丙氨酸165.07901.02×10-32.17氨基酸代谢胆碱121.11033.13×10-41.61脂类代谢葡萄糖180.06343.82×10-30.97糖代谢谷氨酸147.05321.37×10-41.74氨基酸代谢

3讨论

OSCC的发病率正在逐年升高，据文献调查，我国OSCC的发病率约为3.6/10万~8.0/10万人〔4〕，如今已成为我国常见的恶性肿瘤之一。为了诊断OSCC,CT、MRI以及多普勒彩色超声介导下的细针穿刺细胞活检技术，只能够大概定性肿物的良恶性质。目前只有肿物的病理组织活检术才是诊断的唯一标准，但由于地域，医院级别，医师经验等原因，往往许多患者错过了治疗的最佳时机。

代谢组学技术通过对机体内代谢产物的分析，已成为探索人体疾病、诊断疾病的重要手段。文献报道，通过代谢组学技术，已有多种疾病通过生物体液检测到了相关的代谢标志物,而癌症标志物的检测更是受到了众多的关注，如乳腺癌〔5〕、胆道癌〔6〕等。Chen等〔7〕采用HILIC和RPLC对肝癌和健康人的尿液进行分析，发现了21种作为生物标志物的代谢物离子，同时指出两组受试人群在某些氨基酸代谢和脂肪酸氧化方面存在着明显的差异。唾液作为人体的体液之一，由于唾液样品采集具有非侵袭性，受试者无伤害、无痛苦，取样不受时间、地点的限制，因而样品容易获得。唾液作为检测人类机体健康和疾病的新兴递质，近些年受到越来越多的关注，使用唾液进行疾病的诊断和健康的检测将是一种很有前途的检测方法。

根据Warburg Effect效应，不同于正常细胞的分化，大多数肿瘤细胞主要是通过糖酵解作用而产生能量〔8〕。在有氧的条件下，葡萄糖经过糖酵解作用逐步分解生成乙酰CoA进入三羧酸循环，而三羧酸循环不仅是三大类物质(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路，也是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。三羧酸循环的起始物为乙酰CoA，它既是糖氧化分解的产物，也是体内脂类代谢和某些氨基酸代谢的产物，而色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺则是氨基酸代谢的重要产物。苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，在体内大部分经酶催化作用氧化成为酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂类代谢。

胆碱是卵磷脂和鞘磷脂的重要组成部分，也是乙酰胆碱的前体。而胆碱代谢异常是肿瘤形成与发展的特征之一，作为乙酰胆碱的前体物质，胆碱在体内多种代谢过程中都起着至关重要的作用，尤其是磷脂的生物合成。肿瘤细胞在不断增殖过程中时，由于膜的不断合成，需要高水平的胆碱转化为磷脂酰胆碱，因此相比于健康人群，在OSCC患者的唾液中胆碱的含量要高些。当然胆碱代谢异常也有可能是胆碱磷酰化过程中关键酶的高表达效果。谷氨酰胺和谷氨酸通过体内酶的作用，二者可以相互转化。其中谷氨酰胺在免疫细胞的分裂和增殖过程中起到了正调控的作用，同时谷氨酰胺在淋巴细胞的分泌和增殖过程中也起到了关键性的作用，并且参与了淋巴细胞功能的维持。而口腔鳞状细胞癌的转移主要途径是淋巴道转移，谷氨酰胺含量的降低与OSCC的淋巴道转移是否有关，还有待于进一步研究。肉碱由赖氨酸和蛋氨酸合成，在长链脂肪酸的β-氧化过程中起着至关重要的作用，当然其最重要的已知的代谢功能就是可以促进脂肪的运输，帮助脂肪酸运输到线粒体中，在能量代谢中起着关键性的作用。乙酰辅酶A经β-氧化生成并进入三羧酸循环，最终氧化成为CO2，这也导致了能量运载体的减少。与健康人相比，OSCC患者肉碱含量的降低可能由于OSCC患者脂肪酸代谢下调所致。

本研究运用了基于RRLC-Q-TOF-MS的代谢组学技术研究了OSCC患者与健康人群的唾液样品，得到了OSCC患者唾液的代谢轮廓，并发现OSCC患者与健康人群的唾液代谢谱存在着明显的差异，找出并鉴定了7种生物标记物。同时，根据相关代谢通路的分析，与健康人相比，这些生物标记物的变化反映了OSCC患者主要存在着氨基酸代谢水平提高和能量代谢失衡的现象，同时三羧酸循环代谢异常。而由于样品量有限，也导致了实验的局限性，因此还需要大批量的样品和细胞水平实验的验证。

4参考文献

1郑家伟,李金忠,钟来平,等.口腔鳞状细胞癌临床流行病学研究现状〔J〕.中国口腔颌面外科杂志,2007;5(2):83-90.

2Liu SA,Tsai WC,Wong YK,etal.Nutritional factors and survival of patients with oral cancer〔J〕.Head Neck,2006;28(11):998-1007.

3Hanne CB,Nina E,Nanna E,etal.Potential of human saliva for nuclear magnetic resonance-based metabolomics and for health-related biomarker identification〔J〕.Anal Chem,2009;81:9188-93.

4Liu Q,Sun B,Zhang Q,etal.Metabonomics and its applications in early diagnosis of diseases〔J〕.J Int Pharm Res,2013;40(3):265-70.

5 Zhang L,Xiao H,Karlan S,etal.Discovery and preclinical validation of salivary transcriptomic and proteomic biomarkers for the non-invasive detection of breast cancer〔J〕.PLoS One,2014;DOI:10.1371.

6Wen H,Yoo SS,Kang J,etal.A new NMR-based metabolomics approach for the diagnosis of biliary tract cancer〔J〕.J Hepatol,2010;52(2):228-33.

7Chen J,Wang W,Lv S,etal.Metabonomics study of liver cancer based on ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with HILIC and RPLC separations〔J〕.Anal Chim Acta,2009;650(1):3-9.

8Matthew G,Vander H,Lewis C,etal.Understanding the warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation〔J〕.Science,2009;324(5930):1029-33.

〔2015-03-15修回〕

(编辑李相军)

通讯作者：韩成敏(1958-)，男，教授，主要从事口腔颌面部肿瘤研究。

基金项目：吉林省科技发展计划资助项目(2009-11-13)

〔中图分类号〕R739.8

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0560-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.019