延缓衰老汤对衰老模型大鼠的保护作用

曹宝平　马　超　李芳伶　叶厚春　曾令杰

(赣州市人民医院药剂科,江西　赣州　341000)



延缓衰老汤对衰老模型大鼠的保护作用

曹宝平马超李芳伶叶厚春1曾令杰2

(赣州市人民医院药剂科,江西赣州341000)

〔摘要〕目的探讨延缓衰老汤(YT)对D-半乳糖所致衰老大鼠的保护作用。方法选择健康SD大鼠40只，平均分成正常对照组、模型组、阳性对照组和给药组。其中正常对照组不做任何处理，其余三组大鼠腹腔注射D-半乳糖和生理盐水建立亚急性衰老模型，同时，阳性对照组灌胃维生素E，给药组大鼠灌胃YT混悬液，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，连续培养2个月后，测定所有大鼠肝、脑组织中丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、外周血清白细胞介素(IL)-2含量及腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力指标。结果与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肝、脑组织中MDA含量明显升高，SOD含量均显著下降(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组和给药组肝、脑组织中MDA的含量明显降低，SOD的含量明显提高(P<0.01)。模型组大鼠血清IL-2的含量明显低于正常对照组(P<0.01)；而阳性对照组和给药组大鼠血清IL-2含量均显著高于模型组(P<0.01)。模型组吸光度A值明显低于正常对照组(P<0.01)；而阳性对照组和给药组吸光度A值均显著高于模型组(P<0.01)。结论YT通过降低肝、脑组织中MDA含量，提高SOD含量，提高血清中IL-2含量和腹腔巨噬细胞的吞噬能力来延缓D-半乳糖所致的大鼠衰老。

〔关键词〕延缓衰老汤；抗衰老

1赣县人民医院药剂科2寻乌县人民医院药剂科。

第一作者：曹宝平(1973-)，男，副主任药师，主要从事中医药研究。

报道显示，衰老与机体体内的自由基数量不断增加有紧密关系〔1〕。D-半乳糖模型是建立衰老和脑老化模型常用的诱发剂，广泛应用于抗氧化、抗衰老实验中[2]。延缓衰老汤(YT)是我院多年应用于抗衰老的中药汤剂，由地黄、川芎、丹参等15种具有补肾益精、补气养阴、壮肾阳、益精血的中药组方而成，但其抗衰老机制仍不清楚。本研究旨在探讨YT抗衰老能力的作用机制。

1材料与方法

1.1动物选择健康SD大鼠40只，雌雄各半，体质量180~220 g，无特定病原体(SPF)级，由南方医科大学实验动物中心提供，适应性饲养1 w左右，环境温度25℃±3℃，相对湿度为45%~70%，自由进食饮水。将大鼠40只随机分为正常对照组、模型组、给药组、阳性对照组，每组10只。正常对照组雌性4只，雄性6只，体质量(198±0.2)g；模型组雌性5只，雄性5只，体质量(200±0.25)g；给药组雌性7只，雄性3只，体质量(197±0.3)g；阳性对照组雌性4只，雄性6只，体质量(203±0.1)g。四组雌雄比例、体质量相比，均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2药品与试剂YT配制：取地黄30 g，川芎6 g，丹参20 g，当归10 g，泽泻10 g，红花6 g，党参15 g，桃仁10 g，白术10 g，首乌15 g，田七8 g，茯苓15 g，熟地12 g，甘草3 g，枸杞6 g加入适量灭菌注射用水中，100℃煎煮1 h，过滤，调配成1 g/ml的YT，取滤液放冷密封，4℃储存。D-半乳糖(Sigerma进口分装，批号1212495)：广州华科化学技术有限公司；白细胞介素(IL)-2、丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供，批号：20120325。

1.3仪器UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；BC-J80S型细胞培养箱，苏州江东精密仪器有限公司。

1.4方法

1.4.1D-半乳糖衰老模型的建立及给药正常对照组大鼠给予生理盐水1 ml/d腹腔注射，其他各组给予100 mg·L-1·d-1D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续2个月。同时2个月中给药组给予100 mg·kg-1·d-1延缓衰老汤灌胃，阳性对照组给予灌胃25 mg·kg-1·d-1维生素E，其他两组以等量生理盐水灌胃。2个月后，所有大鼠内眦静脉取血，处死大鼠。

1.4.2肝、脑组织中MDA和SOD含量测定使用20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，断颈处死大鼠，取出肝、脑组织，取材后立即存放在液氮中，然后使用冰冷的生理盐水清洗组织表面的血液，使用滤纸吸干表面残余的水分，放入小烧杯中，冰浴，称重。在小烧杯中加入生理盐水，剪碎脏器，倒入匀浆机，手工匀浆10 min，3 000 r/min离心15 min，取肝、脑组织匀浆上清备用，按试剂盒操作检测SOD、MDA含量。

1.4.3测定外周血IL-2含量药物干预后，从大鼠内眦静脉取血置于离心管中，静置30 min后，3 000 r/min离心15min，取血清，按照试剂盒说明书操作，放射免疫法测定IL-2含量。

1.4.4腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力检测无菌收集大鼠腹腔液，4℃离心，10 min，Hank液洗涤细胞3次，1640培养液制备细胞悬液。取3 ml置培养皿中，37℃，5%CO2培养2 h，巨噬细胞黏附于容器表面，用4℃ Hank液吹吸，收集黏附细胞，血球计数板计数并调整细胞密度为2×109/L，置37℃培养箱培养2 h后，弃上清和非贴壁细胞。取贴壁巨噬细胞，加0.1%中性红生理盐水，37℃继续培养30 min，弃中性红，用37℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗巨噬细胞，用50%乙酸和50%乙醇稀释后，用UV-2550紫外分光光度计在540 nm波长测A值。

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件行t检验。

2结果

2.1肝、脑组织中MDA和SOD含量与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肝、脑组织中MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD含量均显著下降(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组和给药组肝、脑组织中MDA的含量明显降低，SOD的含量明显提高(P<0.01)；但是给药组与阳性对照组大鼠MDA和SOD含量均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　肝、脑组织中MDA和SOD含量测定结果

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

2.2大鼠血清IL-2含量模型组大鼠血清IL-2的含量为(3.29±0.16)ng/ml，明显低于正常对照组的(5.23±0.15)ng/ml(P<0.01)；而阳性对照组和给药组大鼠血清IL-2含量分别为(5.10±0.08)ng/ml、(5.04±0.14)ng/ml，均显著高于模型组(P<0.01)，但正常对照组、阳性对照组和给药组大鼠血清中IL-2的含量之间无统计学意义(P>0.05)。

2.3腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力模型组吸光度A值为(0.15±0.04)，明显低于正常对照组的(0.30±0.01)(P<0.01)；且阳性对照组和给药组吸光度A值分别为(0.29±0.03)、(0.27±0.05)，均显著高于模型组(P<0.01)。但正常对照组、阳性对照组和给药组吸光度A值之间无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

关于衰老的机制有很多学说，具有代表性的是自由基学说。长期以来机体内部自由基的产生和自由基的清除处于平衡状态，随着年龄的增长，机体内部发生一系列变化，平衡状态被打破，引起自由基数量增加〔3〕。过多的自由基会攻击核酸、蛋白质等大分子物质，诱导细胞膜上不饱和脂肪酸发生过氧化反应，引起核酸及蛋白质相互交联，基因突变及生物酶活力下降，导致细胞受损，甚至衰老至死亡〔4〕。另外，在发生衰老的过程中，与人体免疫功能下降之间具有紧密联系。现代药理学实验证明具有补肾益精的中药方剂可以提高老年大鼠血清中甲状腺素水平，从而增强胸腺的功能，延缓衰老，促进胸腺上皮细胞合成和分泌IL-2，最终达到增强衰老大鼠的免疫功能[5]。YT可以通过多系统、多环节维持机体的免疫功能，从而延缓衰老。建立衰老模型是评价抗衰老模型的关键，实验中衰老动物模型主要有D-半乳糖衰老模型、臭氧衰老模型、去胸腺衰老模型及自然衰老模型等，其中D-半乳糖衰老模型应用最广泛，具有操作简单、低成本、效果佳等特点〔6〕。本研究主要考虑到D-半乳糖在还原酶的作用下可以生成半乳糖醇，而半乳糖醇不被细胞代谢而在细胞内沉积，从而增加细胞的渗透压，影响细胞的代谢，诱导细胞发生衰老〔7〕。

SOD是机体重要的抗氧化酶之一，可以清除H2O2、·OH和 O-2·等自由基，在体内的含量可以反映出机体清除自由基的能力高低，可以保护细胞免受氧化损伤，随着年龄的增长，其数量及活性逐渐下降，是衡量衰老程度的重要指标〔8〕。MDA是脂质发生过氧化反应的产物，当机体衰老后，机体内MDA的含量会慢慢升高，从而反映氧自由基水平和过氧化反应的程度〔9〕，也可以用于反映机体的衰老状态。本研究提示YT和维生素E可以有效对抗D-半乳糖所致大鼠肝、脑的氧化损伤，均有清除自由基和抗氧化的作用，并且达到延缓衰老的目的。而且YT与维生素E的功效相似。近年来研究表明，YT中组方成分地黄、丹参、首乌、枸杞等具有抗自由基代谢、提高免疫力、防治心脑血管疾病、抗老年痴呆等功效〔10〕。衰老机体的免疫功能及非特异性免疫中巨噬细胞功能下降〔11〕，而IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T细胞产生，是调控免疫应答的主要因子，本研究表明YT和维生素E可以改善衰老大鼠的免疫功能，从而延缓衰老的进程。

综上所述，YT可以通过降低MDA的含量，升高SOD的含量，清除自由基，达到抗氧化的目的，同时也具有增强免疫功能的作用，两个作用结合起来延缓衰老的进程，具有一定的开发价值。

4参考文献

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7王丽梅,叶诚,吴晨,等.紫苏油对衰老模型大鼠的抗衰老作用研究〔J〕.食品科技,2013；38(1):280-4.

8叶刚,杨锐,杨怀铭,等.云南红景天对衰老模型大鼠的抗衰老作用〔J〕.中国老年学杂志,2014；24(14):3960-2.

9邱赛红,蔡颖,孙必强,等.天麻首乌片对D-半乳糖致衰老小鼠机体氧自由基的影响〔J〕.中医药导报,2006；12(10):61-2,66.

10包辉英,吴国忠.中成药抗衰老的现代药理研究进展〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2004；2(4):231-233.

11Fatahinia M,Khosravi AR,Shokri H.Propolis efficacy on TNF-α,IFN-γ and IL2 cytokines production in old mice with and without systemic candidiasis〔J〕.J Mycol Med,2012；22(3):237-42.

〔2015-04-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：马超(1984-)，男，硕士，主管药师，主要从事临床药学方面的研究。

基金项目：赣州市2012年市科技局指导性科技计划项目(No.2012006)

〔中图分类号〕R28

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0547-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.013