Survivin RNAi联合PsL 5F影响MCF-7细胞增殖和凋亡的研究

刘　轩　王润秀　吴小云　谢富华

Survivin RNAi联合PsL 5F影响MCF-7细胞增殖和凋亡的研究

刘轩王润秀吴小云谢富华

【摘要】目的探讨RNAi介导的基因治疗联合天然药物半边旗提取物5F(PsL 5F)对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法采用腺病毒介导Survivin RNAi联合PsL 5F作用乳腺癌细胞MCF-7，免疫印迹法检验Survivin被沉默的程度，通过MTT检测细胞的增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果免疫印迹实验发现Survivin蛋白的表达明显被抑制；MTT实验表明联合作用对细胞增殖的抑制作用从单独应用的50.00%(P<0.001)，提高到86.12%(P<0.001)；流式细胞术也发现联合应用能更大程度地促进细胞的凋亡。结论Survivin RNAi和PsL 5F联合作用，可显著提高对MCF-7细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用，这为肿瘤的综合治疗提供了理论基础和实验室依据。

【关键词】Survivin；RNA干扰；半边旗提取物5F；MCF-7细胞

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:004～006)

乳腺癌发病率在全球一直位居女性肿瘤首位，且还在递增。Survivin是1997年发现的，属IAP基因家族，高表达于很多常见肿瘤[1-2]，而瘤旁组织和成熟分化组织并不表达。因此，若能抑制Survivin 表达则可能有助于乳腺癌等的治疗。半边旗，系凤尾蕨科植物，为南方常用生药之一，有止血、生肌、解毒、消肿之功效[3]。梁念慈等从其干燥全草中分离出几种二萜类化合物，并证明包括5F在内至少有3种二萜类成分具有很高的抗肿瘤活性[4-6]。他们的研究表明PsL 5F主要是通过线粒体途径诱导包括HO-8910PM、HL-60、BLE-7402、A549和K562等癌细胞凋亡[7-8]。然而，PsL 5F具体的抗肿瘤机制有待进一步阐明。

1材料与方法

1.1　材料

MCF-7细胞株购自上海拜力生物科技有限公司，RPMI 1640培养基和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司，GENMED腺病毒纯化试剂盒购自展晨生物有限公司，MTT购自Sigma公司，Survivin一抗购自SantaCruze公司，PsL 5F药物由广东医学院天然药物开发中心梁念慈教授惠赠(纯度为98%)，细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1细胞及其培养MCF-7细胞株培养于100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，含10%胎牛血清，并按16 U/100 ml 加入精制胰岛素培养，37 ℃、5%二氧化碳孵箱。当细胞贴壁生长汇合达90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2重组腺病毒Ad-Survivin滴度和感染效率的测定取13 μl病毒液，按1∶75稀释于10 mM Tris-Cl中，用该稀释液调零测波长260 nm时的吸光度值，重复测量3次。取平均值代入公式：病毒滴度=A260×75×1012(pt/ml)计算。采用β-gal染色法检测病毒的感染效率。

1.2.3PsL 5F药物的配制PsL 5F药物粉末用DMSO 配制成10 mg/ml，分装冻存，临用前用培养基稀释成所需浓度。处理细胞时DMSO最终浓度<0.1%。

1.2.4MTT实验消化MCF-7细胞并调整浓度为1×105/mL，接种96孔培养板，每孔100 μl，常规条件下过夜；按组给予0、6.25、12.5、25、50、100和200 μM的PsL 5F，每组设3个复孔；24 h或48 h后每孔加入10 μl MTT (5 g/L)，继续培养4 h。倾去培养液，每孔加入100 μl DMSO溶解，用微量振荡器摇振15 min，测定吸光度(A)；实验重复3次。据公式计算抑制率并获得药物IC50，计算公式：细胞增殖抑制率(%)=(1-给药组细胞A值/对照组细胞A值 )×100%。

1.2.5Ad-Survivin联合PsL 5F对细胞的作用同上方法接种细胞于96孔板。细胞贴壁后分别给予PBS、Ad-Survivin(MOI=100)、PsL 5F(终浓度为IC50)和Ad-Survivin(MOI=100)联合PsL 5F(终浓度为IC50)，每组设3个复孔。分别于24 h、48 h和72 h采用MTT法检测细胞增殖情况。

1.2.6免疫印迹检测Survivin蛋白接种细胞于6孔板，1×106/孔。细胞贴壁后分别给予PBS、Ad-Survivin(MOI=100)、PsL 5F(终浓度为IC50)和Ad-Survivin联合PsL 5F。作用48 h提取细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入第1 抗体于室温孵育2 h，用TBST 缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入第2抗体于室温孵育2 h，再用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入发光试剂(ECL) 显色，X光片曝光。

1.2.7Annixin V-FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡处理后48 h，胰酶消化(避免过度消化)至细胞将要脱壁，去除消化液；轻轻将细胞吹下，转移至离心管，1 000转/min离心5 min，尽量去净上清，PBS轻轻重悬细胞计数；取5万-10万重悬细胞，1 000转/min离心5 min，去上清，加195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；室温避光孵育10 min；1 000转/min离心5 min，去上清，加190 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入10 μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；立即FCM检测。

1.3　统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料均采用完全随机设计的单因素ANOVA。

2结果

2.1　重组腺病毒Ad-Survivin滴度和感染效率的测定

测波长260 nm时的吸光度值，重复测量3次，取平均值代入公式获得病毒滴度为1.2×1011pt/ml。β-gal染色后可见病毒感染24 h后约80%被感染，而病毒感染48 h后几乎所有的细胞被感染。

2.2　PsL 5F对细胞的增殖抑制情况

分别用0～200 μM的PsL 5F作用MCF-7细胞24 h后，MTT法测定细胞增殖抑制率，计算得IC50≈110 μM。结果表明PsL 5F能明显抑制MCF-7细胞的增殖(6.25、12.5、25、50、100和200 μM相当于对照组的P值分别为0.001、<0.001、0.020、<0.001、<0.001、<0.001)，且存在剂量效应关系(图1)。

图1　PsL 5F对MCF-7细胞增殖抑制情况

2.3　Survivin表达情况

Ad-Survivin作用MCF-7细胞48 h后，蛋白质印迹实验发现Survivin蛋白的表达明显被抑制(图2)，表明重组腺病毒介导Survivin RNAi发挥了作用。

图2　Survivin蛋白表达的沉默情况

2.4　Ad-Survivin联合PsL 5F对细胞的作用

PsL 5F(110 μM)联合Ad-Survivin作用MCF-7细胞48 h，MTT实验发现单独应用Ad-Survivin对细胞增殖的抑制率为52.00%，单独应用PsL 5F为60.00%，然而联合应用则可提高到86.12%(P<0.001)。

2.5　流式细胞仪检测细胞凋亡情况

单独应用PsL5F和Ad-Survivin，早期和晚期凋亡细胞总数分别为19.06%和27.20%，而联合应用则可提高至32.50%，且以晚期凋亡细胞为主。

3　讨论

肿瘤是多因素、多基因、多阶段综合作用的的结果[9]。目前，化疗作为治疗恶性肿瘤的三大常规手段之一，已广泛应用于多种肿瘤的治疗。然而由于其不能有效地靶向肿瘤细胞，故在发挥抗癌作用的同时带来了一系列毒副反应，而且容易产生耐药性和死灰复燃的现象。于是，人们想到基因治疗的方法，将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用。尤其近来RNAi技术的出现更为肿瘤的基因治疗注入新鲜的活力[10-11]。目前已有很多针对Bcl-2 、survivin、EGFR、VEGF等基因的RNAi在体内外有效地抑制了肿瘤细胞的生长[12-14]。然而，虽然目前肿瘤的基因治疗研究可谓是如火如荼，但是作为肿瘤的治疗手段仍不成熟，比如基因的导入方法等尚需进一步完善。因此，在研究肿瘤基因治疗的同时，还应该发展基因治疗与化疗、与中医药治疗及其他生物治疗相结合的综合治疗。鉴于此，本研究以天然药物半边旗提取物5F(PsL 5F)和凋亡抑制基因Survivin为研究对象，以Survivin高表达的乳腺癌细胞MCF-7为研究模型，采用重组腺病毒介导的RNAi方法联合PsL 5F作用进行一种治疗综合治疗的体外研究。研究结果发现单用PsL 5F和RNAi方法，对细胞的增殖抑制率分别为60%和52%，而联合应用则可提高到80%(P<0.05)。细胞凋亡检测实验发现细胞凋亡指数从19.06%和27.20%提高至32.5%。综上所述，本研究采用Survivin RNAi和PsL 5F联合作用的方法，可显著提高对肿瘤细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用，这为减少肿瘤药物用量和毒副作用提供有力的实验室依据。

参考文献

[1]钟永泷,林辉,李柏钧,等.非小细胞肺癌组织CCR9和Survivin及Bcl-2表达相关性研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2013,20(16):1232-1235.

[2]李庆霞,颜聪亚,闫晓路,等.乳腺浸润性导管癌组织FGFR1和Survivin表达临床意义分析〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2013,20(17):1315-1322.

[3]江苏新医学院.中药大词典，上册〔M〕.上海：上海科技出版社，1973：782-783.

[4]催燎,张晓,梁念慈,等.一种新二萜类化合物的体外抗肿瘤研究〔J〕.中国药理学通报,1998,14 (1):50-52.

[5]叶华,吴琼,郭蒙,等.半边旗活性成分5F对C26结肠癌细胞cAMP水平的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2012，39(11):2150-2152.

[6]龚先玲,梁念慈,邓亦峰.半边旗中抗肿瘤成分6F的分离纯化〔J〕.亚太传统医药,2012,8(9):29-30.

[7]陈杰,庞江琳,覃燕梅,等.5F对绒癌JAR细胞增殖、细胞周期及PTEN、cyclinD1表达的影响〔J〕.中国妇幼保健,2012,27(11):1693-1695.

[8]陈杰,庞江琳,覃燕梅,等.5F对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞PTEN、MMP-9表达的影响〔J〕.华中科技大学学报(医学版),2012,41(2):147-151.

[9]万德森.临床肿瘤学,第二版〔M〕.北京:科学出版社,2006:22-32.

[10]谢富华,王润秀,李昌武,等.Survivin shRNA重组腺病毒的构建及其对人肺癌细胞A549的作用〔J〕.肿瘤防治研究,2009,36(4):19-23.

[11]白爱民,贾艳敏,张晓菁.siRNA 为基础的RNAi 在肿瘤基因治疗中的应用进展〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2007,14(12):953-955.

[12]Liu WS,Zhu F,Jiang Y,et al.siRNA targeting survivin inhibits the growth and enhances the chemosen-sitivity of hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Oncol Rep,2013,29(3):1183-1188.

[13]Zou M,Xia S,Zhuang L,et al.Knockdown of the Bcl-2 gene increases sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitors in the H1975 lung cancer cell line harboring T790M mutation〔J〕.Int J Oncol,2013,42 (6):2094-2102.

[14]Takahashi M,Chiyo T,Okada T,et al.Specific inhibition of tumor cells by oncogenic EGFR specific silencing by RNA interference〔J〕.PLoS One,2013,8(8):e73214.

(编辑：吴小红)

The Effect of Survivin RNAi Combined with PsL 5F on the Proliferation and Apoptosis of MCF-7 Cell

LIUXuan,WANGRunxiu,WUXiaoyun,etal.GanzhouCancerHospital,Ganzhou,341000

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of gene therapy,mediated by RNAi combined with PsL 5F on the proliferation and apoptosis of tumor cells.MethodsAfter treated with Survivin RNAi combined with PsL 5F for 48 hours,Survivin was knockdowned by Western blot.The cell proliferation of MCF-7 cells were assayed by MTT,and the flow cytometry was used to detct the cell apoptosis.ResultsAfter 48 hours combined treatment,Survivin was significantly knockdowned,and the inhibitory rate on the proliferation of MCF-7 cells improved from about 50 percent(P<0.001)to 86.12 percent(P<0.001).And also the combined treatment could strongly promote cells apoptosis.ConclusionSurvivin RNAi joint PsL 5F could enhance the inhibition of MCF-7 cell proliferation and promote cell apoptosis,and it could provide laboratory evidence for reducing dosage and side effects of cancer chemotherapy drugs.

【Key words】Survivin;RNA interference;PsL 5F;MCF-7 cells

中图分类号：R73-36

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0004-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.002

通讯作者：谢富华

基金项目：作者单位:341000 赣州市肿瘤医院(刘轩)；341000 赣南医学院第一附属医院(王润秀)；341000 赣南医学院生物化学与分子生物学教研室(吴小云)；341000 赣南医学院分析与检测实验教学中心(谢富华)

收稿日期(2015-02-10修回日期 2015-06-05)