维生素K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究

王光丽　周小辉

维生素K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究

王光丽周小辉

【摘要】目的探讨维生素K2抑制肝癌细胞(HCC)增殖的可能机制。方法人肝癌细胞株(HuH7)传代培养，以不同浓度的(0、10、30 μM)维生素K2处理HuH-7细胞96 h，以实时定量PCR测定和Western印迹分析分别测定血小板衍生因子α受体(PDGFR-α)mRNA和蛋白的表达；用pluc-a2(PDGFRα启动子荧光素酶载体)转染人肝癌细胞株(HepG2)，用维生素K2处理24 h后采用荧光素酶测定其荧光活性。结果维生素K2抑制HuH7细胞的增殖；维生素K2以剂量依赖的方式抑制PDGFR-α mRNA和蛋白的表达；PDGFR-α启动子的活性被维生素K2抑制并呈剂量依赖关系。结论维生素K2可能通过下调PDGFR-α的转录抑制肝癌细胞的增殖。

【关键词】维生素K2；肝癌细胞；血小板衍生因子α受体

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:014～017)

肝细胞癌(HCC)是最常见恶性肿瘤之一。在癌症相关的死亡中，肝癌居于第3位[1-2]。到目前为止，包括肝内注射给药在内的密集化疗已被应用于晚期肝细胞癌的治疗。然而，由于复发率高及癌组织对门静脉的侵袭，患者的愈后并不乐观[3-4]。

维生素K是1种脂溶性维生素，属于结构相似的2-甲基-1，4萘醌亲脂家族，该家族包括维生素K1、K2和K3[4-5]。迄今为止，维生素K2在日本被广泛应用于骨质疏松症的治疗，无明显副作用[4]。最近的研究发现，维生素K2在体内外均能抑制包括肝癌细胞在内的众多肿瘤细胞的增殖[1,3,6]。另一项临床研究表明，维生素K2预防了病毒性肝硬化导致的肝细胞癌的发生[7]。然而，维生素K2抑制肝癌增殖的机制尚不明确。血小板衍生因子受体α(PDGFRα)与配体结合后，便处于激活状态，能引起细胞内特异性底物的磷酸化，这些底物属于受体酪氨酸激酶家族[8-9]。在基底细胞癌、脑肿瘤、胃肠道间质瘤等多种肿瘤组织中，PDGFR-α的表达明显升高。近期的一项研究发现，与癌旁组织比较，肝癌组织中PDGFR-α的表达也是升高的。小鼠体内高表达肝特异性的PDGFR-α配体PDGF-CC，逐步进展为肝硬化与肝癌[10]。抗PDGFR-α单克隆抗体具有抑制多种人与小鼠来源的肿瘤细胞的增殖，其中包括肝细胞癌的细胞系[2]。根据上述研究结果，我们假设PDGFR-α可能在肝癌的进展中发挥重要作用，抑制PDGFR-α可能对于肝癌治疗是有意义的。既往研究显示维生素K2处理肝癌细胞(HepG2)后，采用基因芯片技术测定发现PDGFR-α的表达是下降的[11]。那么维生素K2抗肿瘤增殖的作用，是否可能通过抑制PDGFRα的表达实现的？

1材料与方法

1.1　材料

肝癌细胞系HuH7与HepG2(ATCC),DMEM培养基(GIBCO公司,美国)，胎牛血清(Signa公司，美国)，维生素K2(Eisai公司，日本)，MTT(Roche公司,美国)，PDGFR-α 与β-actin抗体(Santa Cruz公司，美国)，磷酸钙转染试剂盒(Invitrgen公司，美国)，荧光素酶测定试剂盒(Promega公司，美国)，RNA提取试剂盒(Nakalai Tesque公司，日本)，逆转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司，美国)，ABC试剂盒(Vector,Burlingame,美国)。包含PDGFR-α启动子区域的质粒pluc-a2由日本兵库大学医学院的Yutaka Kitami教授馈赠。维生素K2来自日本Eilai公司，以酒清作为溶剂，配制不同浓度的维生素K2储液(0.01,0.1,1,10,30 mM)，然后用DMEM-10%胎牛血清(FBS)稀释至工作液的乙醇浓度3‰。

1.2　方法

1.2.1细胞培养人肝肿瘤细胞HuH7与HepG2均用DMEM培养基培养，加入10%胎牛血清(FBS)，青霉素(100 U/ml),链霉素(100 mg/ml)，在37 ℃含5%CO2饱和湿度的细胞孵育箱中培养。细胞融合达80%以上时，用胰酶(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化传代。细胞经不同浓度的维生素K2处理96 h后，用于后续实验。对照组细胞加入与实验组终浓度相同的酒精。HuH7用于MTT、荧光定量PCR和western blot，HepG2细胞用于荧光素酶测定实验。

1.2.2四氮唑蓝比色分析法(MTT比色法)取对数生长的HuH7细胞接种于96孔板中，细胞密度为2.5×103/孔，加入100 μl培养基。细胞贴壁后，加入含有不同浓度维生素K2(0.01,0.1,0,1,10,30 μM)的新鲜培养基。细胞孵育48、72及96 h后，加入MTT1液继续孵育4 h，每孔中加入100 μl溶剂DMSO，选择单波测定(540 nm)，采用酶联免疫检测仪测定每孔的光密度值，并将OD测定值转换为相应细胞数予以计算。

1.2.3实时荧光定量RT-PCR采用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7细胞96 h后，按照试剂盒说明(Nakalai Tesque,Kyoto,Japan) 提取细胞总RNA，浓度调整为0.5 μg/μl。用分光光度计，在260 nm与280 nm处分别测定RNA样本的吸光度值。A260/A280 1.8的样本中提取1 μg总RNA进行RT-PCR。20 μl PCR反应体系中加入1 μl cDNA，终浓度为0.2 μM的上游与下游引物，混匀，4 000 rmp瞬间离心，20 ℃反应10 min,37 ℃反应120 min,85 ℃反应5 S,4 ℃反应5 min结束，逆转录产物进行实时定量PCR。基因表达水平用ABI PRISM 7700序列测定系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)根据说明书来检测。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃30 s，循环40次。引物序列如下：PDGFR-α 上游:5'-GACCCTATGCAGCTGCCTTA-3',下游:5'-GGAAGCTACCCTATTCTTATG-3';β-actin上游:5'-CCTAGAAGCATT TGCGGTGG-3',下游:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'。条带的强度用光密度分析仪定量测定，并与参照物β-actin条带结果比对分析。

1.2.4Western bolt用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7细胞96 h后，用预冷的PBS洗2次，加入裂解液冰上裂解(1×PBS,1% NP-40,0.5%去氧胆酸钠,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,45 μg/mL抑肽酶,100 mM原钒酸钠)。离心后收集上清，BCA法测定各样本蛋白浓度，调整上样量一致，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h。加入化学发光液，暗室中显影，用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白条带的灰度值与本组actin的灰度值相除，对所得数值进行统计学处理。

1.2.5瞬时转染与荧光素酶测定PDGFR-α启动子报告基因的结构如图1所示。HepG2细胞接种于直径为35 mm的培养皿中，细胞密度为5×103/孔，用含5%FBS-CCS的不含酚红的DMEM培养。细胞用4 μg Pluc-a2转染,同时用0.1 μg of PRL-TK转染，后者用于矫正转染效率。转染24 h后，培养基更换为含不同浓度(0,10和30 μM)维生素K2的新鲜培养基，孵育24 h，测定细胞裂解液中荧光素酶的活性。

图1　PDGFR-α启动子报告基因的结构

1.3　统计学处理

2结果

2.1　维生素K2对细胞增殖的作用

前期研究发现，维生素K2能以剂量依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖[4]。与此相符，维生素K2也能抑制HuH7细胞的增殖。在HuH7细胞中，与对照组相比，10与30 μM的维生素K2分别抑制细胞增殖的比例为48.9%与65.7% (P<0.05)。基于此发现，我们选择10与30 μM作为进一步研究的药物浓度。

2.2　维生素K2对PDGFR-α mRNA表达的影响

为了探讨维生素K2抑制HuH7细胞增殖的分子机制，以及了解PDGFR-α是否在此过程中发挥作用，我们采用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7肝癌细胞96 h后，用实时定量PCR检测不同组PDGFR-α mRNA的表达。如图2所示，与对照组相比，10与30 μM的维生素K2处理的细胞中PDGFR-α mRNA的表达分别减少了(0.65±0.37)和(0.94±0.05)(P<0.01)。维生素K2以剂量依赖的方式抑制PDGFR-α mRNA的表达。

图2　维生素K2对PDGFR-α mRNA表达的影响

2.3　维生素K2对PDGFR-α蛋白表达的影响

用不同浓度维生素K2处理细胞96 h后，western blot检测不同组PDGFR-α蛋白的表达，用Quantity One软件测定条带的灰度值。如图3所示，维生素K2显著抑制PDGFR-α蛋白的表达。10 和 30 μM浓度的维生素K2处理组细胞内PDGFR-α的蛋白表达水平分别为对照组的(0.53±0.03)和(0.57±0.05)倍(P<0.05)。由此可见，维生素K2不仅抑制PDGFR-α mRNA，同时也抑制蛋白的表达。随后，我们检测维生素K2是否也在转录水平抑制PDGFR-α的表达。

图3　维生素K2对PDGFR-α蛋白表达的影响

2.4　维生素K2对PDGFR-α启动子活性的影响

荧光素酶实验用于检测维生素K2对PDGFR-α启动子区域活性的作用。PDGFR-α报告基因质粒瞬时转染HuH7细胞，随后检测荧光素酶的活性。如图4所示，10和30 μM浓度的维生素K2处理组细胞内PDGFR-α的荧光素酶相对活性分别为对照组的(0.75±0.12)和 (0.49±0.38)(P<0.05)。维生素K2抑制了PDGFR-α启动子活性。

图4　维生素K2对PDGFR-α转录的影响

3　讨论

研究发现，维生素K2具有抑制肝癌细胞增殖的作用[4,8]。与此相符，我们的研究表明，用维生素K2处理细胞96 h后，HuH7细胞的增殖以维生素K2剂量依赖的方式受到抑制。当用10 μM的维生素K2处理细胞时，细胞的数量明显减少。细胞数量的减少是由于增殖受到抑制，而不是细胞死亡。因为，在镜下并未观察到培养基中存在大量死亡细胞的现象。到目前为止，维生素K2抑制肝癌增殖的机制并不明确。

PDGFR是特异的蛋白酪氨酸激酶细胞表面受体，有2种亚型，即PDGFR-α和-β。在PDGFR与其相应的配体结合后，信号转导通路便被激活[12]。在生长发育过程中，PDGFR-α在许多组织中发挥作用，它参与增殖、形态发生、上皮与间质的相互作用[11,13]。近期的一项研究发现，PDGFR-α仅在恶性程度高的肝细胞肿瘤组织的内皮中高表达[10]。另有研究发现，以PDGFR-α为靶向的单克隆抗体处理人与小鼠肝癌细胞，能有效地抑制PDGFR-α的表达和细胞的增殖与转移；同样的，肝癌小鼠模型中的研究也表明，此单克隆抗体还能延长肝癌小鼠的生存期[2]。基于上述研究结果，我们可以做出假设：PDGFR-α可能参与维生素K2抑制肝癌增殖的机制。我们既往的研究发现，维生素K2能减少PDGFR-α的表达。

在本研究中，我们检测了维生素K2对PDGFR-α mRNA与蛋白表达，以及对PDGFR-α启动子区活性的影响。首先，用实时定量PCR的方法检测PDGFR-α mRNA的表达。结果表明，用不同浓度的维生素K2处理细胞96 h后，随着维生素K2的浓度增加，PDGFR-α的表达逐渐减少。随后，我们用western blot的方法检测PDGFR-α蛋白的表达，结果与实时定量PCR的结果相符，PDGFR-α的表达以维生素K2剂量依赖的方式减少。以上研究结果表明，维生素K2能同时抑制PDGFR-α mRNA与蛋白的表达。然而，我们并不知道维生素K2的抑制作用是否因为其与PDGFR-α的启动子相互作用所致。最后，我们用瞬时转染与荧光素酶报告基因的方法，检测维生素K2对PDGFR-α启动子活性的影响。研究发现，随着维生素K2的浓度增加，PDGFR-α的活性逐渐减弱。

越来越多的研究表明，PDGF信号通路与几种病理状态相关，其中包含了纤维变性疾病，如肺纤维化、肝纤维化、硬皮病等[14]。近期的一项研究发现，过度表达PDGFR-α的一种配体PDGFR-C能导致肝纤维化，后者是由于胶原沉积于细胞外周与静脉周围形成的病理改变[15]。我们推测维生素K2可能通过抑制PDGFR-α的表达改善肝硬化。维生素K2改善肝纤维化的作用机理以及PDGFR在此过程中的作用，还有待进一步研究。然而，我们的研究为维生素K2抑制肝癌增殖的作用提供了依据，可能的分子机制是维生素K2抑制了PDGFR-α的表达。维生素K2可能成为肝细胞癌的潜在治疗剂。

参考文献

[1]Kaneda M,Zhang D,Bhattacharjee R，et al.Vitamin K2 suppresses malignancy of HuH7 hepatoma cells via inhibition of connexin 43〔J〕.Cancer Lett,2008,263(1):53-60.

[2]Matsumoto K,Okano J,Nagahara T,et al.Apoptosis of liver cancer cells by vitamin K2 and enhancement by MEK inhibition〔J〕.Int J Oncol,2006,29(6):1501-1508.

[3]Mizuta T,Ozaki I,Eguchi Y,et al.The effect of menatetrenone,a vitamin K2 analog,on disease recurrence and survival in patients with hepatocellular carcinoma after curative treatment:a pilot study〔J〕.Cancer,2006,106(4):867-872.

[4]Alvarez RH,Kantarjian HM,Cortes JE.Biology of platelet-derived growth factor and its involvement in disease〔J〕.Mayo Clin Proc,2006,81(9):1241-1257.

[5]Habu D,Shiomi S,Tamori A,et al.Role of vitamin K2 in the development of hepatocellular carcinoma in women with viral cirrhosis of the liver〔J〕.JAMA,2004,292(3):358-361.

[6]Ozaki I,Zhang H,Mizuta T,et al.Menatetrenone,a vitamin K2 analogue,inhibits hepatocellular carcinoma cell growth by suppressing cyclin D1 expression through inhibition of nuclear factor kappaB activation〔J〕.Clin Cancer Res,2007,13(7):2236-2245.

[7]Otsuka M,Kato N,Shao RX,et al.Vitamin K2 inhibits the growth and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells via protein kinase A activation〔J〕.Hepatology,2004,40(1):243-251.

[8]Pinzani M,Gesualdo L,Sabbah GM,et al.Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synthesis and growth of cultured rat liver fat-storing cells〔J〕.J Clin Invest,1989,84(6):1786-1793.

[9]Xie J,Aszterbaum M,Zhang X,et al.A role of PDGFRalpha in basal cell carcinoma proliferation〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(16):9255-9259.

[10]Gotzmann J,Fischer AN,Zojer M,et al.A crucial function of PDGF in TGF-beta-mediated cancer progression of hepatocytes〔J〕.Oncogene,2006,25(22):3170-3185.

[11]Liu W,Nakamura H,Yamamoto T,et al.Vitamin K2 inhibits the proliferation of HepG2 cells by up-regulating the transcription of p21 gene〔J〕.Hepatol Res,2007,37(5):360-365.

[12]Oseini AM,Roberts LR.PDGFRalpha:a new therapeutic target in the treatment of hepatocellular carcinoma? 〔J〕.Expert Opin Ther Targets,2009,13(4):443-454.

[13]Zhang T,Sun HC,Xu Y,et al.Overexpression of platelet-derived growth factor receptor alpha in endothelial cells of hepatocellular carcinoma associated with high metastatic potential〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(24 Pt 1):8557-8563.

[14]Stock P,Monga D,Tan X,et al.Platelet-derived growth factor receptor-alpha:a novel therapeutic target in human hepatocellular cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2007,6(7):1932-1941.

[15]Bonello MR,Khachigian LM.Fibroblast growth factor-2 represses platelet-derived growth factor receptor-alpha (PDGFR-alpha) transcription via ERK1/2-dependent Sp1 phosphorylation and an atypical cis-acting element in the proximal PDGFR-alpha promoter〔J〕.J Biol Chem,2004,279(4):2377-2382.

(编辑：吴小红)

Mechanisms of Vitamin K2 on Suppression of Proliferation of Hepatocellular Carcinoma

WANGGuangli,ZHOUXiaohui.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou,515041

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of inhibition proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines in vitro.MethodsHuman hepatoma cells (HuH7) were treated with various concentrations of vitamin K2 for 96 h,then the expression of PDGFR-α mRNA and protein was investigated by real time PCR and western blot analysis respectively.human hepatoma cells (HepG2) were transfected with pluc-a2 (PDGFR-α promoter-luciferase vector),and the luciferase activity after 24 h treatment with Vitamin K2 was assessed.ResultsVitamin K2 suppressed the expression of PDGFR-α mRNA and protein in a dose dependent manner.The PDGFR-α promoter activity was suppressed by Vitamin K2 administration in a dose dependent manner.ConclusionVitamin K2 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via down-regulating the transcription of PDGFR-α.

【Key words】Vitamin K2；Human hepatoma cells；Platelet-derived growth factor receptor-α

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0014-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.005

通讯作者：周小辉

基金项目：作者单位:515041 汕头大学医学院第一附属医院

收稿日期(2015-01-01修回日期 2015-04-22)