喉癌患者血浆中miRNA表达及基于靶基因的能量消耗的研究

吴　硕　牛　健　李　丽　刘　冰　闫加兴　曲学华

喉癌患者血浆中miRNA表达及基于靶基因的能量消耗的研究

吴硕牛健李丽刘冰闫加兴曲学华

【摘要】目的研究喉癌患者血浆中miRNA表达及基于靶基因的能量消耗。方法收集5例喉癌患者的病理组织。空腹抽血，分离人喉癌细胞系Hep2，从HEp2细胞中提取所有RNA。同时采用食物频率问卷(FFQ)收集患者日常饮食频率。同时进行营养生物标志物研究，记录4天的饮食记录(4DFR)进行饮食调整(DM)。结果实时PCR结果显示，与无转染的喉癌细胞比较，在pcDNA3/ Pri-miR-1转染的HEp2喉癌细胞中miR-1水平升高3.8倍。但是在miR-1 ASO转染的HEp2细胞中miR-1下降了70%。miR-1能够促进HEp2细胞集落形成，但不影响细胞生存力。患者能量消耗研究发现，与对照患者比较，脂肪和总能量消耗增加的风险因素是喉癌患者的身体质量指数和年龄。结论研究表明，miRNA可改变癌症细胞中的脂质和氨基酸代谢；miRNA可以成为治疗癌症的新靶点。

【关键词】喉癌；miRNA；能量消耗；风险比；临床治疗

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:018～021)

MicroRNAs(miRNA)是非编码小RNA，其负面通过与它们的靶基因的mRNA的非编码区3相互作用，实现mRNA翻译或稳定性调节作用[1]。mRNA的3＇非编码区包含关键的稳定要素，其受到各种调节蛋白调控，同时也是miRNA的结合位点。肿瘤相关的miRNA表达已被多项研究确定和分析，且不同的miRNA特征对于许多类型的癌症，包括喉癌[2]。此外，依据细胞类型，人类恶性肿瘤中多个miRNA表达失调，表现出致癌或抑制肿瘤的特性。其中进化最保守的miRNA是miR-1，高度富集于心脏和肌肉，对祖细胞和成肌的增殖起重要作用。在这项研究中，我们喉癌患者血浆中miRNA表达及基于靶基因的能量消耗。

1材料与方法

1.1　一般资料

收集我院2013年12月至2014年6月收治的5例喉癌患者的病理组织。5例患者皆为男性，平均年龄(57±10.4)岁，年龄48～71岁。1例患者出现肺部转移。2例接受不同范围的喉部分切除术,1例接受喉全切术，2例行电子喉镜下病变组织活检。3例病灶在声门，2例在声门上区。根据国际肿瘤协会(TNM)分期：1例为T3N0M1；2例为T3N0M0；2例为T1N0M0。

1.2　细胞培养、转染和RNA的隔离

入院后第2天清晨空腹抽血，血液标本收集后在超净工作台中进行以下操作，低温高速离心机离心后吸取上层血浆转移至无酶EP管中，放置在-80 ℃冰箱保存备用。

人喉癌细胞系Hep2维持在RPMI 1640中，补充有10%胎牛血清(FBS)，青霉素100 IU/ml和100 μg/ml链霉素。细胞系保持在37 ℃的加湿室中补充5%CO2。用脂质体2000试剂按照制造商的方案进行转染。使用TRIzol试剂从HEp2细胞中提取所有RNA。

1.3　免疫组化法

筛取5对原发性喉鳞状细胞癌组织和邻近正常组织。4 ml组织切片进行抗原修复,121 ℃的微波组织相容处理器持续5 min。其次在3%过氧化氢阻断过氧化物酶5 min，正常山羊血清蛋白阻断10 min。

1.4　能量消耗评估

采用食物频率问卷(FFQ)收集患者日常饮食频率。同时进行营养生物标志物研究，记录4天的饮食记录(4DFR)进行饮食调整(DM)。应用双标水(DLW)技术客观测量短期总能量消耗，可用于能量消耗的校准(校正)和估计。每7天调查访问1次，共2次。第一次访问包括资格确认;知情同意书;身高和体重的测量； FFQ问卷和膳食补充剂等;收集血液和尿液标本。第二次访问时，收集24 h尿标本和空腹血样。2周的总能量消耗调查，从氧-18和氘的相对尿消除率估算。体重稳定的人,客观地估计2周总能耗。同样，蛋白质消耗通过6.25×24 h尿氮/0.81进行客观估计。本研究获得患者知情同意书及医学伦理委员会批准。

1.5　统计学方法

所有统计数据应用SPSS 18.0统计软件进行分析。采用非配对t检验组间统计学显着性差异。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1　miR-1抑制HEp2喉癌细胞的生长

为了研究miR-1对细胞表型的影响，我们首先提出了miR-1的表达构建体pcDNA3/ Pri-miR-1，并确认了其效果。实时PCR结果显示，与无转染的喉癌细胞比较，在pcDNA3/ Pri-miR-1转染的HEp2喉癌细胞中，miR-1水平升高了3.8倍。但是，miR-1在miR-1 ASO转染的HEp2细胞中下降了70%。MTT分析评价细胞生存力。为了进一步确定miR-1对HEp2细胞生长的影响，进行了集落形成测试。pcDNA3/ Pri-miR-1转染的HEp2细胞克隆形成率下降75%，miR-1 ASO转染的HEp2细胞增加了近3倍，相对于各自的对照组。合成突变的miR-1，其中6个碱基发生突变，结果显示突变的miR-1不影响HEp2喉癌细胞活力。这些结果表明了miR-1能够促进HEp2细胞集落形成，但不影响细胞生存力，见图1。

A、B分别为Pri-miR-1、miR-1 ASO转染促进HEp2细胞中的miR-1表达；C、D分别为pcDNA3/ Pri-miR-1转染的HEp2细胞克隆形

2.2　患者机体能量消耗变化及意义

根据能量消耗总量和脂肪密度的校准方程系数对患者能量消耗进行评估。由表1可见(DLW能量)线性回归(自报能量)系数和标准差，并显示了其他因素的影响。由表2可见，4DFR脂肪密度增加40%和4DFR总能量消耗增加20%时，是否采用能量标志物校准的风险比与控制BMI无差异。

表1　能量消耗总量和脂肪密度的消耗结果(系数，标准差)

注：SE为标准差。

表2　4DFR脂肪密度增加40%和4DFR总能量消耗增加20%的风险比

3　讨论

3.1　miRNA参与葡萄糖代谢

微RNA(miRNA)是非编码，18-24个核苷酸长度的RNA连接到靶mRNA的3'非翻译区(UTR)，从而改变基因表达[3]。世界第一例miRNA-LIN-4，及其目标基因lin-14是在线虫中发现的。自那时以来，大量的miRNA已经确定，并从蠕虫到哺乳动物都是高度保守的。代谢改变是癌症的共同特征。通常情况下，非癌细胞通过氧化磷酸化的线粒体产生三磷酸腺苷(ATP)分解代谢葡萄糖的。然而，即使在正常的氧存在下，增殖的癌细胞代谢葡萄糖显著增加乳酸。这一现象被称为 "Warburg效应" (沃伯格效应)。利用糖酵解提供能量，为癌细胞适应缺氧和酸性环境(乳酸生产)提供了多种优势，助于癌细胞的侵袭和快速增殖。氧化应激和细胞中高水平的ROS(活性氧)在肿瘤形成了至关重要的作用。癌细胞使用丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)来对抗高氧化应激。因为已经发现miRNA在癌症细胞中表达异常，累积的研究表明，miRNA通过调节癌基因和抑癌基因，在肿瘤生长过程中起到重要的作用[4]。在过去的几年里，大量的研究发现miRNA参与调节癌细胞的代谢。糖类，蛋白质，脂质和核酸代谢都受到了miRNA的影响从而细胞的生长。正如“Warburg效应”所示，葡萄糖代谢的改变可导致癌细胞的增殖。其原因可以解释为miRNA特定修改糖酵解途径。大量研究报道miRNA参与调节基因转录和葡萄糖转运(GLUTs)。miRNA能够通过调节癌组织中的一些GLUTs的表达从而控制葡萄糖的摄取。此外，杨等人报道，miR-21调控膀胱癌中的GLUT1和GLUT3的表达。此外，包括肾细胞癌的一项研究表明了miR-1291调节GLUT1的表达[5]。

3.2　miRNA参与脂类和氨基酸代谢

脂质是合成细胞器和细胞的关键生物材料。改变脂质代谢是癌症代谢的独特功能。多数的miRNA参与调节癌症脂质代谢。研究发现miR-122通过控制1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶1(Agpat1)的表达，以调节肝癌细胞的脂肪和胆固醇的代谢，细胞死亡诱导DFFA效应和相关脂质转移蛋白4(Stard4)[6]。研究已经证实miR-185和miR-342在前列腺癌细胞通过减少固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和固醇调节元件结合蛋白的表达2(SREBP-2)和下调节它们的靶基因，包括脂肪酸合酶(FASN)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)，控制脂肪和胆固醇的生成[7]。最近，已经证实了miR-205通过靶向酰基-CoA合成酶长链家族成员1(ACSL1)，撤去调节肝细胞癌的脂代谢作用。miRNA调节氨基酸的分解代谢。Liu等报道了miR-32b调节肾癌脯氨酸氧化酶。这些研究表明，miRNA改变癌症细胞中的脂质和氨基酸代谢。

3.3　miRNA成为治疗癌症的目标基因

代谢改变在肿瘤发展和转移起着重要一步。针对癌症代谢而开发的抗癌疗法具有巨大潜力。现有许多类型的化合物已被开发专门抑制肿瘤发展过程中的关键代谢酶。然而，某些细胞的代谢过程与癌症细胞相似，如T淋巴细胞使用谷氨酰胺代谢[8]。研究表明，miRNA丧失调节功能，不影响正常细胞的生长，但显著减少癌细胞生长。这表明，miRNA可以成为治疗癌症的新靶点。此外，肿瘤抑制基因p53诱导几种miRNA，如miR-34，let-7，miR-107和miR-200，都参与调节LDHA，Myc和SIRT1的表达[9]。这些表明，P53/miR-34在肿瘤抑制中起着主要代谢调节作用，调节目标LDHA，Myc和SIRT1或其他代谢途径或酶将成为癌症治疗的创新策略。miRNA可以作为抗癌治疗目标和工具，然而，动物模型的发展，以及研究癌症相关的miRNA和miRNA /抗miR的体内递送的有效性仍是一个主要的临床研究障碍[10]。

综上所述，miRNA是癌症代谢的重要调节器。miRNA通过调节基因和酶的表达，参与糖酵解和能量代谢/途径，从而控制癌症的代谢。

参考文献

[1]张思毅,卢仲明,宋新汉,等.喉癌组织中的 microRNA 差异表达谱及 miR-125a-5p 抑制喉癌细胞增殖的初步研究〔J〕.中国病理生理杂志,2013,29(1):86-92.

[2]郭艳,尚超,钟鸣,等.喉癌中 microRNA-24 对 S100A8 基因 3.非翻译区的作用〔J〕.解剖科学进展,2011,17(3):280-283.

[3]宋岩,刘秀萍,白伟良,等.LY294002 联合顺铂阻断 P13K-Akt 通路诱导喉癌 Hep-2 细胞凋亡研究〔J〕.实用肿瘤杂志,2013,28(2):132-134.

[4]吴一波,沈志森,余星,等.喉癌相关 miRNA 的研究进展〔J〕.基础医学与临床,2012,32(5):583-586.

[5]李群,陆达锴,崔翔,等.非编码 RNA 在喉癌发生中的作用及其临床意义〔J〕.中国细胞生物学学报,2013,35(12):1797-1805.

[6]孙玉满,吴蒙,刘宏侠,等.喉癌切缘组织中 p53 p21 及 PCNA 表达及其与肿瘤复发的关系〔J〕.中国肿瘤临床,2014,41(16):1036-1040.

[7]刘翼,李明慧,郭文佳,等.MicroRNA-10b 对人肺腺癌细胞株 A549 增殖及侵袭能力的影响〔J〕.实用癌症杂志,2013,28(5):469-471.

[8]沈志森,詹国文,邓红霞,等.微小 RNA-519b-3p 对人喉癌 Hep-2 细胞增殖的抑制作用及其机制〔J〕.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,49(2):151-156.

[9]赵娟霞,谢海龙.MicroRNA 参与喉癌相关基因表达的调控〔J〕.国际病理科学与临床杂志,2012,32(3):222-225.

[10]丁罡,黄钢.microRNAs 在肺癌研究中的进展〔J〕.实用癌症杂志,2012,27(3):312-314.

(编辑：甘艳)

Plasma-based miRNA Target Gene Expression and Energy Consumption in

Laryngeal Cancer

WUShuo,NIUJian,LILi,etal.FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150001

【Abstract】ObjectiveTo study the plasma-based miRNA target gene expression and energy consumption in laryngeal cancer.MethodsPathology tissues of 5 cases of laryngeal cancer were collected.Fasting blood,isolated from human laryngeal carcinoma cell line Hep2,all RNA were extracted from HEp2 cells.Food frequency questionnaire(FFQ)was used to collect the frequency of patients daily diet.Meanwhile nutritional biomarker studies,4-day diet records(4DFR)were recorded to conduct dietary adjustments(DM).ResultsReal-time PCR results showed that compared to non-transfected cells larynx in pcDNA3 / Pri-miR-1 transfected HEp2 laryngeal cancer cells,miR-1 levels increased by about 3.8 times.However,miR-1 reduced about 70% in miR-1 ASO transfected HEp2 cells.miR-1 could promote HEp2 cell colony formation,but did not affect cell viability.Energy consumption of patients showed that compared to control patients,the total energy consumption of fat and increased risk factors for laryngeal cancer patients were body mass index and age.ConclusionmiRNA can change lipid and amino acid metabolism of cancer cells;and miRNA may become a new target for cancer therapy.

【Key words】Laryngeal;miRNA;Energy consumption;Hazard ratio;Clinical treatment

中图分类号：R739.65

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.006

通讯作者：曲学华

基金项目：作者单位:150001 哈尔滨医科大学附属第四医院

收稿日期(2015-02-06修回日期 2015-10-13)