肾胺酶预防大鼠缺血再灌注致急性肾损伤的机制研究



·基础研究论著·

作者单位：510120 广州，广州医科大学附属第一医院肾病科

肾胺酶预防大鼠缺血再灌注致急性肾损伤的机制研究

急性肾损伤(AKI)在住院患者中的发病率达21.6%，病死率达23.9%，并加快慢性肾衰竭的进展速度，因此对其的诊断及防治是临床和基础研究的热点[1-3]。AKI的病因多种多样，其中以缺血再灌注损伤(IRI)最常见。肾胺酶是近年来发现的、主要由肾小管上皮细胞合成和分泌并降解循环系统中儿茶酚胺的蛋白质，对其研究领域最初主要集中在心血管系统，后来发现其能够改善缺血再灌注(IR)引起的器官损伤，譬如心脏、脑和肾脏等[4-7]。但是，目前有关肾胺酶对IR所致AKI(IR-AKI)的预防作用，其具体机制尚未完全阐明，因此进一步探讨肾胺酶预防IR-AKI的机制，为其在AKI的应用具有重要意义。本研究构建IR-AKI的大鼠模型，予外源性人重组肾胺酶预处理，旨在了解外源性人重组肾胺酶对IR-AKI的影响，并探讨其可能机制。

材料与方法

一、实验动物与主要试剂

实验用SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-(粤)2011-0015。实验方案通过广州医科大学动物伦理审查委员会审核批准，实验在广州医科大学实验动物中心完成。重组人肾胺酶购自以色列ProSpecbio公司；兔抗鼠Bax及Bcl-2多克隆抗体均由武汉博士德公司提供，山羊抗兔二抗由北京中杉金桥公司提供，丙二醛由南京建成生物工程研究所提供。

二、方　法

1. 动物分组

36只SD雄性大鼠适应性喂养7 d后随机分为假手术组、空白对照组(IR组)、肾胺酶干预组(IR+肾胺酶组)，每组各12只。

2. IR-AKI大鼠模型的构建

参照文献[8]方法，建立IR-AKI的SD大鼠模型：10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉生效后，腹正中线行一3~4 cm切口，找到左肾门，分离输尿管游离出左肾蒂；动脉血管夹夹闭肾蒂，肉眼可见左肾由鲜红转为暗红，最后呈紫黑色，30 min后松开血管夹，待观察左肾充血由紫黑转暗红再转为鲜红色后，肾表面可见散在出血点，切除右肾，缝合切口。假手术组大鼠仅游离出双侧肾蒂，不夹闭肾动脉，伤口用生理盐水纱布覆盖，30 min后缝合切口。IR+肾胺酶组按照文献[9]方法，麻醉前20 min腹腔注射重组人肾胺酶(1 mg/kg)；IR组麻醉前腹腔注射等剂量0.1 ml生理盐水。18 h后3组大鼠麻醉后开腹，下腔静脉采血后全部处死，血液经高速离心后留上清血浆于-20℃保存，留取左肾组织行石蜡切片。

3. 肾脏组织病理改变的观察

3组SD大鼠肾脏组织的石蜡切片经常规苏木素-伊红染色后，观察及评估其肾脏组织损伤的程度，包括肾小管上皮细胞水肿、坏死，肾小管萎缩、扩张，炎症细胞浸润等，采用肾小管损伤指数进行评估。每张切片在高倍镜视野(×400)下取外髓皮质部10个视野，半定量分析肾小管损伤指数：①正常，计0分；②轻微损伤，指受损肾小管<5%，计1分；③轻度损伤，指受损肾小管占5%~25%，计2分；④中度损伤，指受损肾小管占26%~75%，计3分；⑤重度损伤，指受损肾小管>75%，计4分。比较3组SD大鼠的肾小管损伤指数。

4. 肾脏组织Bcl-2及Bax蛋白表达检测

采用免疫组织化学(IHC)染色法，对3组SD大鼠肾脏组织的石蜡切片按常规程序脱蜡及抗原修复，3%H2O2灭活内源性酶，用山羊血清封闭，然后严格按说明书进行兔抗大鼠Bax免疫组织化学染色和兔抗大鼠Bcl-2免疫组织化学染色。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，在肾脏中主要表达于肾小管上皮细胞，阳性表达为棕黄色或黄褐色。Bax蛋白可促进细胞凋亡，也是主要表达于肾小管细胞胞浆中，阳性表达为棕黄色或黄褐色。先在光镜低倍视野(×100)下观察反应结果，然后用IPP 6.0软件计算高倍视野(×400)平均光密度(OD值)，根据光密度值分析3组SD大鼠的Bax及Bcl-2蛋白表达情况。

5. 肾功能指标的检测

采用日本奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪检测3组SD大鼠的血清肌酐和血尿素氮水平。

6. 血清丙二醛水平的检测

严格按照说明书采用硫代巴比妥酸(TBA) 法测定3组SD大鼠的血清丙二醛水平，用分光光度计记录532 nm处OD值，再将数据代入公式，算出血清丙二醛含量。每次检测重复操作2次，结果取平均值。

三、统计学处理

结果

一、大鼠肾脏组织形态学改变

1. 总体表现

假手术组大鼠肾脏外观形态、色泽和大小正常，外表面呈鲜红色，冠状切面可见色泽从皮质到髓质由淡红向深红颜色加深；IR组肾脏体积增大，颜色为紫红或紫黑色，表面有散在的出血点，冠状切面可见皮质苍白，肾髓质淤血。IR+肾胺酶组介于两者之间。

2.光镜下观察

经苏木素-伊红染色后，假手术组SD大鼠的肾小球和肾小管区未见异常，肾小球完整，结构清晰，球囊比例正常；肾小管管腔基底膜完整，可见刷状缘，见图1A。IR+肾胺酶组可见局部肾小球膨大，肾小囊裂隙变窄，球囊比轻度增大；肾小管基底膜基本完整，肾小管上皮细胞轻度肿胀，空泡样和玻璃样变，部分近端小管上皮细胞刷状缘缺失或脱落，偶见管腔淡红色染色；肾间质轻微水肿，局部有少量炎症细胞浸润，见图1B。IR组球囊比明显增大，偶可见肾小囊基膜破裂；肾小管上皮细胞弥漫肿胀和坏死，胞浆呈空泡状，刷状缘基本缺失，管腔充满碎片；肾间质水肿，炎症细胞浸润，比IR+肾胺酶组更严重，见图1C。

图1　假手术组、IR+肾胺酶组、IR组SD大鼠的肾脏病理检查结果(苏木素-伊红染色，×400)

3. 3组SD大鼠的肾小管损伤指数比较

经IR处理18 h后，假手术组、IR+肾胺酶组、IR组的肾小管损伤指数分别为0.15±0.03、1.70±0.23、3.51±0.40，3组间比较差异有统计学意义(F=312.548，P<0.001)，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.001)。

二、3组SD大鼠肾组织的Bcl-2和Bax蛋白表达水平比较

1. Bcl-2

假手术组可见肾小管上皮细胞少量Bcl-2阳性表达，而IR组Bcl-2阳性细胞多于假手术组，IR+肾胺酶组的Bcl-2阳性细胞均较假手术组和IR组增多，见图2。假手术组、IR组、IR+肾胺酶组Bcl-2的OD值分别为28.6±4.1、81.5±7.2、148.3±7.6，3组Bcl-2的OD值比较差异有统计学意义(F=1 028.109，P<0.001)，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.001)。

图2　假手术组、IR+肾胺酶组、IR组SD大鼠肾组织的Bcl-2蛋白表达(IHC染色，×400)

2. Bax

假手术组可见少量Bax蛋白表达，IR+肾胺酶组的Bax阳性细胞比假手术组增多、比IR组减少，见图3。假手术组、IR组、IR+肾胺酶组Bcl-2的OD值分别为23.6±3.5、112.5±8.4、52.5±5.7，3组Bax的OD值比较差异有统计学意义(F=641.083，P<0.001)，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.001)。

图3　假手术组、IR+肾胺酶组、IR组SD大鼠肾组织的Bax蛋白表达(IHC染色，×400)

三、3组SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比较

3组SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比较差异均有统计学意义(P均<0.001)，IR+肾胺酶组的血清肌酐、血尿素氮水平均比IR组降低(t分别为10.144、6.015，P均<0.001)，但均高于假手术组(t分别为11.258、8.088，P<0.001)，见表1。

表1假手术组、IR组、IR+肾胺酶组

注：与假手术组比较，aP<0.01；与IR组比较，bP<0.01

四、3组SD大鼠的血清丙二醛水平比较

假手术组、IR组、IR+肾胺酶组的血清丙二醛分别为(3.61±0.79)、(9.74±1.28)、(7.51±0.54) μmol/L，3组血清丙二醛水平比较差异有统计学意义(F=135.982，P<0.001)，IR组与IR+肾胺酶组血清丙二醛水平均高于假手术组(t分别为14.111、14.107，P均<0.001)；与IR+肾胺酶组相比，IR组血清MDA水平更高(t=5.561，P<0.01)。

讨论

AKI是急性肾衰竭的早期阶段，其病因多种多样，病理生理机制尚未完全阐明[10]。其中肾脏IR-AKI在临床上十分常见，预后不理想[11]。因此，积极寻求有效的AKI防治方法具有重要意义。目前认为，缺血、缺氧导致肾脏组织炎症细胞浸润，肾脏组织细胞凋亡、坏死和氧化应激损伤组织等参与了IR-AKI的病理生理过程[12]。

肾胺酶被发现已经有10余年，研究主要集中在心血管和慢性肾衰竭领域，其作用机制尚存在争议[13-14]。最近研究发现，肾胺酶不仅在降低血压、控制心率和抑制心肌肥厚等心血管疾病中扮演重要角色，还能对IRI的器官具有保护作用。Lee等[9]发现，肾胺酶能够预防顺铂诱导的肾小管上皮细胞株HK-2损伤，炎症因子表达明显减少，在肾胺酶基因敲除小鼠中，不能耐受IRI。但是肾胺酶预防IR-AKI的作用机制尚未完全阐明。肾胺酶是作为单胺氧化酶降解循环中的儿茶酚胺改善缺血器官供血还是作为细胞因子与一种未知受体结合起作用，抑或存在其他未知机制尚存在争议。

本研究建立SD大鼠IR-AKI模型后，SD大鼠血尿素氮和血清肌酐水平均比假手术组明显升高，提示其肾功能下降，其肾脏形态学进一步表明建模成功。IR前予外源性人重组肾胺酶预处理，肾功能受损程度显著减轻，肾小管损伤指数明显下降，说明了肾胺酶能够保护肾小管上皮细胞，减轻IR-AKI。

研究同时发现，IR+肾胺酶组的促凋亡蛋白Bax表达比IR组减少，抗凋亡蛋白Bcl-2表达比IR组表达增多。因此，肾胺酶可能是通过抑制凋亡蛋白表达和促进抗凋亡蛋白表达，从而保护肾小管上皮细胞免遭受IRI。

肾脏IR后会产生大量的自由基，自由基一方面直接参与对组织细胞损伤，另一方面自由基会作为第二信使参与细胞级联反应[15]。自由基作用于脂质发生过氧化反应，终产物为丙二醛，丙二醛本身具有细胞毒性。因此丙二醛的水平能够反映机体过氧化程度。IR+肾胺酶组的丙二醛水平明显低于IR组，由此可见肾胺酶具有减少丙二醛生成，达到稳定细胞膜脂质成分，减少细胞毒性物质生成的作用，从而使IR后肾小管上皮细胞免受氧化应激产物的损伤。

IR-AKI是一个复杂的病理生理过程，本研究通过对IR-AKI大鼠模型予肾胺酶预处理，观察氧化应激产物、凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的水平，推测肾胺酶预防IR-AKI大鼠模型是通过减少氧化应激产物丙二醛、抑制凋亡蛋白和促进抗凋亡蛋白的表达，研究结果将为肾胺酶在AKI的防治应用提供依据。本研究尚有不足之处，如未从RNA及蛋白质等水平动态观察表达情况，也没有对上述各项指标行多个时间点观测，肾胺酶还可能通过其他作用参与IR-AKI的保护机制等，日后我们将进一步深入研究以获取更多可靠的证据。

参考文献

[1]Coca SG, Singanamala S, Parikh CR.Chronic kidney disease after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis.Kidney Int,2012,81(5):442-448.

[2]Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, Jaber BL; Acute Kidney Injury Advisory Group of the American Society of Nephrology.World incidence of AKI: a meta-analysis.Clin J Am Soc Nephrol,2013,8(9):1482-1493.

[3]李广然, 张涤华. 挤压伤致急性肾衰竭的治疗. 新医学, 2008, 39(11): 708-709.

[4]Luft FC.Renalase, a catecholamine-metabolizing hormone from the kidney.Cell Metab,2005,1(6):358-360.

[5]Farzaneh-Far R, Desir GV, Na B, Schiller NB, Whooley MA. A functional polymorphism in renalase (Glu37Asp) is associated with cardiac hypertrophy, dysfunction, and ischemia: data from the heart and soul study.PLoS One,2010,5(10):e13496.

[6]Desir GV, Wang L, Peixoto AJ.Human renalase: a review of its biology, function, and implications for hypertension.J Am Soc Hypertens,2012,6(6):417-426.

[7]Li X, Huang R, Xie Z, Lin M, Liang Z, Yang Y, Jiang W.Renalase, a new secretory enzyme: Its role in hypertensive-ischemic cardiovascular diseases.Med Sci Monit,2014,20:688-692.

[9]Lee HT, Kim JY, Kim M, Wang P, Tang L, Baroni S, D’Agati VD, Desir GV.Renalase protects against ischemic AKI.J Am Soc Nephrol,2013,24(3):445-455.

[10]Okusa MD, Davenport A.Reading between the (guide)lines-the KDIGO practice guideline on acute kidney injury in the individual patient.Kidney Int,2014,85(1):39-48.

[11]Findlay M, Donaldson K, Robertson S, Almond A, Flynn R, Isles C.Chronic kidney disease rather than illness severity predicts medium- to long-term mortality and renal outcome after acute kidney injury.Nephrol Dial Transplant,2015,30(4):594-598.

[12]Molitoris BA.Therapeutic translation in acute kidney injury: the epithelial/endothelial axis.J Clin Invest,2014,124(6):2355-2363.

[13]Eikelis N, Hennebry SC, Lambert GW, Schlaich MP.Does renalase degrade catecholamines? Kidney Int,2011,79(12):1380.

[14]Xu J, Li G, Wang P, Velazquez H, Yao X, Li Y, Wu Y, Peixoto A, Crowley S, Desir GV.Renalase is a novel, soluble monoamine oxidase that regulates cardiac function and blood pressure.J Clin Invest,2005,115(5):1275-1280.

[15]Kim J, Jung KJ, Park KM.Reactive oxygen species differently regulate renal tubular epithelial and interstitial cell proliferation after ischemia and reperfusion injury.Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(5):F1118-F1129.

(本文编辑：林燕薇)

吴永东汪华林林蓉宇蒋强袁春玲

【摘要】目的探讨肾胺酶在预防肾脏缺血再灌注(IR)致急性肾损伤(AKI)的作用及机制。方法选择36只SD大鼠制作IR-AKI模型，随机分成假手术组(仅游离出双侧肾蒂，不夹闭肾动脉)、空白对照组(IR组，缺血前30 min腹腔注射生理盐水)、肾胺酶干预组(IR+肾胺酶组，缺血前20 min腹腔注射肾胺酶1 mg/kg)3组。于IR 18 h后，取肾脏组织行苏木素-伊红染色和免疫组织化学检查，光镜下观察病理学改变，比较凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平；静脉采血测血尿素氮、血清肌酐和丙二醛含量。结果IR+肾胺酶组的血清肌酐、血尿素氮和丙二醛水平和急性肾小管坏死指数均低于IR组(P均<0.01)、高于假手术组(P均<0.01)。IR+肾胺酶组的Bcl-2蛋白表达均高于IR组和假手术组(P<0.01)。IR+肾胺酶组的Bax蛋白表达低于IR组(P<0.01)、高于假手术组(P<0.01)。结论肾胺酶可减轻肾脏IR导致的AKI，其机制可能是通过抑制氧化应激产物的产生，并与上调Bcl-2抗凋亡蛋白和下调Bax促凋亡蛋白表达有关。

【关键词】肾胺酶；缺血再灌注；急性肾损伤；氧化应激；凋亡

Mechanism of renalase in prevention of acute renal injury induced by ischemia and reperfusionWuYongdong,WangHualin,LinRongyu,JiangQiang,YuanChunling.DepartmentofNephropathy,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor,WangHualin,E-mail:hualinwang@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of renalase in preventing acute kidney injury (AKI) induced by renal ischemia/reperfusion (IR). MethodsA total of 36 IR-AKI SD rat models were established and randomly divided into the sham-operated group (renal pedicle was separated without renal artery clipping), normal control (IR group, intraperitoneal injection of normal saline at 30 min before ischemia)group and renalase intervention group (IR+renalase group, intraperitoneal injection of 1.5mg/kg of renalase at 30 min before ischemia). At 18 h after IR, renal tissues were collected for H.E staining and immunohistochemical analysis and observed for pathological changes under light microscope. The expression levels of Bcl-2 and Bax were detected and statistically compared among three groups. The contents of serum creatinine, urea nitrogen and serum malonyldialdehyde were measured. ResultsThe levels of serum creatinine, urea nitrogen, serum malonyldialdehyde and acute tubular necrosis scoring index in the IR+ renalase group were significantly lower than those in the IR group (all P<0.01), whereas considerably higher compared with those in the shame-operated group (all P<0.01). The expression of Bcl-2 in the IR+renalase group was significantly higher compared with those in both the IR and shame groups (both P<0.01). The expression level of Bax in the IR+renalase group was significantly lower than that in the IR group (P<0.01) but dramatically higher compared with that in the sham-operated group (P<0.01). ConclusionsRenalase can alleviate IR-induced AKI probably by inhibiting the production of oxidative stress products, down-regulating the expression of of Bax and up-regulating the expression of Bcl-2.

【Key words】Renalase; Ischemia reperfusion; Acute kidney injury; Oxidative stress;Apoptosis

收稿日期：(2015-09-28)

通讯作者，汪华林，E-mail：hualinwang@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30801140)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.004