CCR5与支气管哮喘免疫学发病机制研究进展



·综述·

作者单位：510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院儿科

CCR5与支气管哮喘免疫学发病机制研究进展

支气管哮喘(哮喘)的本质是气道的慢性免疫性炎症，这种慢性炎症主要与气道的高反应性有关，通常出现广泛而多变的可逆性气流受限，导致反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，多种细胞(如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞)和细胞组分共同参与这种慢性炎症过程[1-2]。趋化因子作为免疫系统重要的调节因子，对这些炎症细胞的活化和迁移发挥着重要作用。CC趋化因子受体5(CCR5)可能在哮喘的发生与发展中起到重要的作用。

趋化因子是一类能趋化细胞定向迁移的小分子分泌蛋白，由70~100个氨基酸组成，分子量为8~12 kD，至今已发现50多种趋化因子，根据其N末端半胱氨酸残基的空间位置可分为4个亚类：CXC类(α类趋化因子)、CC类(β类趋化因子)、CX3C类与C类。趋化因子受体根据与其结合的趋化因子同样分为4个亚类：CXCR、CCR、CX3CR和CR，它们是由约330个氨基酸组成的七次跨膜转运(TM1-TM7)G蛋白偶联受体，由N端、3个胞外环、3个胞内环及C端组成，其中N端序列是无糖基化保守序列，为趋化蛋白受体多样化区，在与受体结合及信号转导中发挥关键作用，C端富含丝氨酸和苏氨酸残基，其磷酸化能够极大地增强N端肽段的信号转导功能[3]。绝大多数趋化因子受体有1~4个位于胞外的N端糖基化结构域，这使得趋化因子受体可以与多种配体结合。如CCR3可与嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)，单核细胞趋化因子2、3、4(MCP-2、3、4)，受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)结合。趋化因子也可以与不同的受体结合，如eotaxin可与CCR2、CCR5、CXCR3结合，正是这种趋化因子及其受体相互作用的冗余才使趋化因子系统在体内的精细调控成为可能[4]。趋化因子受体与其配体结合后通过酪氨酸激酶信号转导，使G蛋白构象改变后活化，引起胞外钙离子内流、胞内钙离子释放，使细胞内钙离子浓度迅速升高，从而引起一系列病理生理反应。

一、CCR5及其配体的结构与生物学特征

1. CCR5的结构

CCR5为β趋化因子的受体，结构上可分为：胞外N-末端、3个胞外环(EL1-3)、3个胞内环(IL1-3)、7个跨膜α螺旋和胞内C-末端(图1)，相对分子质量为40 600 U，由352个氨基酸残基组成，主要表达于静止期记忆性T细胞、单核细胞和未成熟的树突状细胞的细胞膜上，具有调控T细胞和单核细胞/巨噬细胞系的迁移、增殖与免疫功能。CCR5基因定位于人染色体3p21，含4个外显子和2个内含子[5]。CCR5基因序列存在2个独立的启动子，按照其存在位点不同分别命名为Pu和PD，Pu和PD可被多种转录因子(NF-κB1、NF-κB2、GATA-1、AP-1、GATA-2、GATA-3、STAT3、STATIα、STATIβ)识别并结合，发挥其作为启动子激活CCR5转录的活性。基因的转录调节具有细胞特异性，有研究表明，NF-κB和(或)环磷酸腺苷/反应元件结合蛋白(cAMP/CREB)通路是激活CCR5启动子转录活性的关键环节。

图1　CCR5的一级结构(Paterlini MG, 2002年)

2. CCR5的天然配体

CCR5的天然配体为CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)和CCL5(RANTES)。

巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)属于CC类趋化因子，1988年Davatelis等从内毒素刺激的小鼠巨噬细胞的上清液中纯化到一种二聚体蛋白质，鉴于其炎症属性，将其命名为MIP，MIP由相对分子量约为8 kD的2个肽(MIP-1a和MIP-1b)组成，两者氨基酸序列同源性达68%，之后他们以小鼠RAW264.7巨噬细胞构建了模板DNA文库，以上述2个肽N端氨基酸编码序列为探针，先后克隆了mMIP-1a 模板DNA 和MIP-1b 模板DNA，分别编码mMIP-1a 模板DNA蛋白和MIP-1b模板DNA蛋白。小鼠每种蛋白各由1种基因编码，而人类至少含有3种MIP-1a基因(LD78a、LD78b与LD78g)及2种MIP-1b基因(AT744.1与AT744.2)，除LD78γ为伪基因外，余下基因均可转录。人MIP-1a基因定位于17q11.2-12，由3个内含子和2个外显子组成。多种细胞(如中性粒细胞、活化T细胞、单核细胞、成纤维细胞、肥大细胞及某些肿瘤细胞)均有分泌MIP-1a的潜能，CCR1、CCR3 和CCR5均为其受体[6]。MIP-1a与其靶细胞表面的受体结合后，通过引发钙离子的变化诱导信号转导，参与介导趋化免疫细胞、抑制造血干细胞生长及抑制HIV 感染等进程[7]。

人MIP-1β基因定位于17号染色体，与LD78a基因相近，同样由3个内含子和2个外显子组成，编码92个氨基酸的前蛋白。业已证实，单核细胞、活化的T/B细胞、NK细胞、中性粒细胞在抗原或细胞因子的刺激下均可分泌MIP-1b，发挥增强T细胞迁移过程的黏附作用，活化参与阻止修复的巨噬细胞，是机体清除有害微生物的重要因子[8]。其既有助于缓解有害的慢性炎症，又可对急性炎症反应作出有利的应答。

RANTES/CCL5是由T细胞分泌的小分子蛋白，相对分子量8 kD，染色体定位于17q11.2-q12区域，基因序列长度为276 bp，其与MIP-1a、MIP-1b有较高的同源性。除T细胞外，上皮细胞、血小板、内皮细胞、一些肿瘤细胞和类风湿性关节炎滑膜的成纤维细胞也产生RANTES，通过4种趋化因子受体传导信号(其中CCR1和CCR5是高亲和力受体，CCR3为中亲和力受体，而CCR4是低亲和力受体)，并以2种不同的信号转导途径激活T细胞：低浓度(以nmol/L为单位)时，RANTES 通过经典的GPCR途径，引起T细胞瞬时钙离子内流、受体极化和细胞迁移；高浓度(以mmol/L为单位)时，RANTES可通过蛋白酪氨酸激酶介导的途径，引起持续性钙离子内流、过度磷酸化和细胞活化。RANTES不仅具有趋化效应，还参与调节机体的免疫应答，调节单核细胞和淋巴细胞的生物学活性。能协同抗原信号共刺激T细胞，促进T细胞克隆的增殖和IL-2的产生，并能通过特异性地趋化记忆T细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞参与介导免疫炎症反应。

3. CCR5信号通路

CCR5与相应配体结合后激活G蛋白异源三聚体解离为a与bg亚单位，其中a亚单位对腺苷酸环化酶(AC)有抑制作用，bg亚单位激活磷脂酶Cb(PLCb)和磷酸酰肌醇三激酶(PI-3K)。PLCb激活导致4，5-二磷酸脂酰肌醇水解，产生第二信使1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油，最终促使细胞内钙离子释放，级联进而激活蛋白激酶C(PKC)。PKC激活CCR5的C-末端磷酸化，活化下游的转录相关信号传导和内化通路。细胞内钙离子的释放刺激富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)，该酶主要涉及细胞运动及迁移，同时它能活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)、p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)，这些信号通路在T细胞增殖和细胞因子的表达中有至关重要的作用[9]。PI-3K激活参与调控细胞生存、增殖及凋亡的蛋白激酶B(PKB)。同样，Rho GTP酶在该路径也被激活，参与调节肌动蛋白细胞骨架的结构、细胞黏附、细胞极性及运动。

CCR5除了通过经典的G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路介导胞内信号转导外，Ganju等(2000年)发现其也可通过其配体CCL5/RANTES与受体结合，促使CCR5中的酪氨酸残基快速磷酸化，激活不依赖GPCR的信号通路；CCR5与CCL4/巨噬细胞炎症蛋白-lb(MIP-lb)结合后介导相关黏附聚焦酪氨酸激酶(RAFTK，又称Pyk2或CAK-b)磷酸化及RAFTK、Syk、Grb2和SHPl多聚信号复合体的形成，参与信号转导进程。

因此，CCR5在免疫反应中免疫细胞的浸润与活化起着关键性作用，见图2[10]。

图2　CCR5信号通路

二、CCR5与哮喘

1. CCR5与哮喘免疫学发病机制

关于哮喘的免疫学发病机制，经典学说认为Th1/Th2细胞平衡失调，是哮喘发病的重要基础，T细胞失衡损伤了机体正常的免疫耐受功能，从而导致免疫细胞及其成分对自身组织结构和功能的破坏。研究表明Th1 细胞表达CCR5和CXCR3，而Th2细胞表达CCR3、CCR4和CCR8[11]。哮喘中Th2细胞表达数量增加、功能活化，伴随大量Th2型细胞因子的分泌，是气道炎症启动和维持的关键性因素，因此大多学者认为Th2细胞的优势或过度分化参与了哮喘的发病机制[12]。

以往对趋化因子受体及其配体与哮喘的研究主要集中于CCR3、CCR8、RANTES等。近年的研究中，CCR5在哮喘中的作用已引起了关注。Schuh等(2002年)用烟曲霉孢子激发慢性真菌诱导的哮喘小鼠模型后发现：缺乏CCR5(CCR5-/-)的烟曲霉致敏小鼠的气道高反应性明显低于野生型(CCR5+/+)，表现出较轻的支气管周围T细胞、嗜酸性粒细胞浸润及气道重塑。研究结果提示，CCR5及其配体RANTES对气道高反应性和过敏性炎症有增强作用。但Walker等(2007年)的研究表明，CCR5在过敏性哮喘中作为上调基因参与了气道高反应性发生、发展，但其与嗜酸性粒细胞炎症严重程度无关。上述结果可能与小鼠种类、选用的致敏原不同及造模时间等因素有关。岳欢等[13]利用SABioscience基因芯片技术检测小鼠哮喘模型中84个趋化因子及其受体基因，有效地筛选出哮喘小鼠差异表达的趋化因子及其受体，发现CCR5及其相应配体CCL3与CCL5表达均增加2倍以上。Kraszula等[14]认为CCR5发挥着双刃剑的作用。一方面，活化的Th1细胞、细胞毒性Tc1细胞表达CCR5，介导效应淋巴细胞向炎症部位迁移，发挥着促炎作用，另一方面，CCR5也表达于调节性T细胞，发挥着抗炎作用。

2. CCR5△32(基因多态性)与哮喘的关系

CCR5△32是指CCR5基因编码区第185位氨基酸密码子以后的32个碱基缺失，导致读码框架错位，缺失了与G蛋白信号通路相关的胞外第三环结构，从而使CCR5蛋白无法正常跨膜表达于细胞膜上，该基因型编码的CCR5含215个氨基酸残基极易被降解，故含有CCR5△32等位基因的纯合子个体细胞表面无CCR5表达[15]。多项研究显示，由于CCR5△32纯和突变的个体编码蛋白质严重缺陷，造成CCR5低表达或不表达，能有效抵抗HIV-1对人的感染[16]。

不同人种和地区CCR5△32与哮喘的关系研究结果各不相同。Hall等(1999年)发现在苏格兰儿童中CCR5△32基因多态性能降低哮喘发生的可能性，CCR5△32与哮喘的发展呈负相关，其提示由于CCR5表达减少导致其对配体CCL3、CCL4和CCL5反应性降低，对哮喘的发生有保护作用。Mitchell等(2000年)对来自西澳313个家庭1 284人研究发现两者并无相关性。但Batra等(2005年)研究发现印度人群中CCR5△32等位基因携带者发生哮喘的风险更高。随后的研究中，Berce(2008年)对斯洛维尼亚非变应性哮喘儿童的研究也证实了Hall等的结论。Ghorban等[17]发现在伊朗东南部哮喘患者中，CCR5△32极为罕见。我国学者孙元亮等(2008年)研究发现在沈阳市城市汉族人群中CCR5△32基因突变与哮喘没有关联。究竟CCR5△32基因突变与哮喘有无关系，或许与人群、地域等因素有关，仍需进一步研究。

3. CCR5与哮喘的治疗

目前国内外研究人员以CCR5为突破点，为哮喘的治疗寻求新方法。我国的李燕等[18]将HSP70和CD80拼接后，以pVAX1(+)质粒为载体构建HSP70/CD80 DNA疫苗治疗卵清白蛋白(OVA)诱发建立的急性哮喘小鼠模型，发现其对OVA致敏激发的急性哮喘小鼠模型的气道高反应性、黏液分泌和气道炎症反应均有明显抑制作用，可能通过上调CCR5及CCL5的表达，下调CCR4及CCL17的表达促进免疫应答向Th1偏移，恢复Thl/Th2平衡，减轻哮喘小鼠模型气道高反应性和气道炎症反应，起到治疗哮喘的作用。研究表明，哮喘作为一种Th2占优势的慢性炎症，Th1细胞同时也起着促炎的作用[19]。因此，日本学者 Suzaki等(2008年)猜想通过阻断CCR5及CXCR3(Th1型)抑制T细胞向肺部募集，从而防止哮喘的发生，利用TAK-779，一种新型CCR5和CXCR3拮抗剂，同时也是一种抗HIV药物，通过干预OVA诱导的小鼠哮喘模型，结果发现TAK-779可以下调CCR5、CXCR3及Th1型细胞因子的表达、改善肺功能、减轻气道炎症，起到防止哮喘发生、发展的作用。CCR5拮抗剂与炎症细胞表面的CCR5特异性结合，从分子水平靶向性地阻断趋化因子对CCR5的作用，抑制了趋化因子对炎症细胞的活化募集。不同于传统的抗炎药，CCR5拮抗剂并非在炎症细胞进入组织后才发挥作用的，而是通过抑制炎症细胞进入组织而达到治疗哮喘的作用。这些都为哮喘的抗炎治疗提供了新策略与新靶点。

三、结语与展望

近年来，人们发现CCR5及其配体在类风湿关节炎、COPD、炎症性肠病、肿瘤、哮喘等疾病中发挥了一定的作用。其中哮喘的本质是气道的慢性炎症，趋化因子及其受体通过与炎症细胞上的G蛋白偶联受体结合影响着特定的炎症细胞亚群的迁移，从而引起一系列病理生理反应。因此，通过对CCR5及其配体相互作用与哮喘关联的深入研究，了解哮喘的发病机制，将对哮喘治疗提供新思路。

以CCR5及其配体为靶点设计新的治疗哮喘药物还存在一些问题。目前尚未确定哪种趋化因子和(或)受体在哮喘发生中发挥主要作用，已知多种趋化因子都可以上调气道反应性，并且趋化因子与受体结合存在专一性及冗余性，因此它们的相互作用是非常复杂的；其次，目前已知CCR5拮抗剂有肽类化合物、非肽类小分子化合物、趋化因子衍生物、单克隆抗体等，不同类型的CCR5拮抗剂具有不同的阻断机制。近年来，利用噬菌体展示技术通过亲和筛选的方法筛选CCR5膜外环特异性结合的模拟肽在炎症性疾病的治疗中崭露头角[20]。因此，选择何种拮抗剂也是今后研究的重点。随着趋化因子及其受体在哮喘发病机制中作用逐渐被阐明，以其为靶点的治疗必将应运而生。

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(本文编辑：林燕薇)

梁蓉蓉黄花荣

【摘要】支气管哮喘(哮喘)是儿童最常见的慢性呼吸道炎症性疾病之一，多种细胞如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等参与该炎症进程。研究表明，趋化因子及其受体通过对炎症细胞的募集与激活，在哮喘的发生、发展中发挥作用。CC趋化因子受体5(CCR5)具有调控T细胞和单核细胞/巨噬细胞系的迁移、增殖与免疫功能，成为哮喘发病机制的研究热点，该文对CCR5及其配体的功能和信号通路与哮喘相关的研究进展进行综述。

【关键词】哮喘；趋化因子；CC趋化因子受体5

Research progress of CC chemokine receptor 5 and pathogenetic mechanism of bronchial asthmaLiangRongrong,HuangHuarong.DepartmentofPediatrics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120，China

Correspondingauthor，HuangHuarong,E-mail:hhrvivi@21cn.com

【Abstract】Bronchial asthma is one of the most common chronic airway inflammation diseases in children. Multiple cells, such as T lymphocytes, eosnophils, neutrophils, mastocyte cells and alternative cells airway epithelial cells participate in the progression of inflammation. Previous studies have indicated that chemokines and their receptors play a role in the incidence and development of bronchial asthma by recruiting and activating inflammatory cells. CC chemokine receptor 5 (CCR5) functions to regulate the migration, proliferation and immunity of T lymphocytes and monocytes/macrophages. CCR5 has become the focus of revealing the pathogenesis of bronchial asthma. This article reviewed the function and signaling pathway of CCR5 and their ligands, as well as their relevance with bronchial asthma.

【Key words】Bronchial asthma; Chemokine; CC chemokine receptor 5

收稿日期：(2015-09-20)

通讯作者，黄花荣，E-mail：hhrvivi@21cn.com

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81370499)；广东省自然科学基金资助项目(2014-A030313020)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.003