黄芪甲苷抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化和转化生长因子β1的表达



·基础研究论著·

作者单位：272092 济宁，济宁医学院附属医院

黄芪甲苷抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化和转化生长因子β1的表达

Myocardial fibrosis

慢性心力衰竭(CHF)是各种器质性心脏疾患的终末阶段，5年存活率和恶性肿瘤类似[1]。在中国34～74岁年龄段的人群，就有超过400万的心力衰竭患者，年病死率高达40%[2]。心肌纤维化是CHF的重要特征之一，而转化生长因子β1(TGFβ1)是最近几年发现的与心肌纤维化、CHF密切相关的细胞因子[3]。黄芪甲苷是中药黄芪制剂中的主要活性成分，同时黄芪甲苷的含量作为黄芪制剂的质量控制标准。黄芪甲苷具有免疫调节、抗炎、抗氧化、保护血管内皮等多效性的作用，本研究采用黄芪甲苷干预CHF大鼠模型，观察其对心肌纤维化、心功能指标等影响，进一步探讨黄芪甲苷的CHF保护作用是否与抑制TGFβ1的表达有关。

材料与方法

一、 材料及动物模型建立

SD雄性大鼠110只(山东鲁抗医药股份有限公司提供，生产许可证号：scxk鲁20130001)，体质量280～300 g。按照参考文献[4]制作大鼠模型，术后连续3 d给予腹腔注射青霉素(20万U/只)，常规喂养。假手术组(10只)穿线而不结扎腹主动脉，其余操作参照模型，术后8周100只结扎大鼠存活65只，存活率65%，随机抽取5只大鼠行血流动力学监测，左心室舒张未压(LVEDP)均大于15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),提示心力衰竭模型成功建立，剩余60只大鼠平均分为空白组、黄芪甲苷(低、中、高)剂量组(20、40、60 mg/kg)、缬沙坦组，每组12只，黄芪甲苷组以及缬沙坦组术后通过灌胃给予相应剂量药物，连续4周，空白组以及假手术组(全部存活)给予相应剂量的生理盐水。

二、 仪　器

电子天平(0～1 000 g)；10%水合氯醛；青霉素(80万U/支，山东鲁抗医药提供)。BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司),全能型ChemiDocMP成像分析系统。黄芪甲苷(纯度>98%，南京青泽医药科技开发有限公司),缬沙坦胶囊(80 mg/粒，北京诺华公司)，兔抗鼠多克隆抗体TGFβ1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH, USA, Proteintech)，Masson染色、RT-PCR、SP试剂盒(武汉博士德公司)。

三、 心脏血流动力学指标检测

末次给药之后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)进行麻醉，测量大鼠体质量,然后在颈部右侧开约为2 cm的纵向切口，分离皮下组织找到颈总动脉，用组织剪在颈总动脉做一斜行切口，将充满肝素生理盐水的PE-50聚乙烯导管插入，缓慢旋转进管，最终进入左心室腔，另一端接在连有BL-420生物机能实验系统的压力换能器上，记录并分析LVEDP、左心室内压最大上升速率/左心室内压最大下降速率(±dp/dtmax)、左心室收缩压(LVSP)、LVMI等指标。

四、 心脏组织采集

待血流动力学指标测量完成后，称量体质量后立即取出心脏，用冰生理盐水洗净血液，滤纸吸干水迹等，称量心脏质量并记录，然后剪取左心室(保留室间隔)，称量左心室质量，计算左室重量/体质量比(LVW/BW，即LVMI)、心脏重量/体质量比(HW/BW)，同时取大约0.5 cm厚的左心室组织置于4%多聚甲醛中用来包埋、切片(5 μm)，以备苏木素-伊红染色、Masson以及免疫组织化学染色，剩余组织放于-80℃中冷藏，用于蛋白免疫印迹法实验。

五、 心肌胶原容积分数(CVF)的测定

按照Masson染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下进行观察，每只大鼠取4个不含血管的视野进行IPP 6.0图像分析系统处理，计算胶原组织所占面积的百分比，取平均值作为每只大鼠的CVF。

六、 RT-PCR检测心肌组织中TGFβ1 mRNA的表达

取上述新鲜组织，用生理盐水灌洗后，按Trizol试剂盒提示方法提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明进行操作，检查其浓度和纯度后，在PCR 热循环仪中逆转录为cDNA(TGFβ1引物上游5’-CCGCAACAACGCAATCTATG-3 下游5’-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3’)。PCR 反应程序为: 94 ℃预变性25 s，GAPDH 52 ℃退火30 s，共30个循环，72 ℃延伸30 s，TGFβ1 56℃退火38 s，共35个循环，72 ℃延伸35 s，PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析仪计算目的带吸光度值，TGFβ1 mRNA 表达的相对强度= TGFβ1条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

七、 心肌组织TGFβ1的表达

参照SP试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，TGFβ1(体积稀释度1∶300)，磷酸盐缓冲液作为阴性对照。阳性表达为棕黄色颗粒。采用图像分析系统进行处理，经过标准灰度值校正，然后随机取每张图片中的5个视野进行积分光密度值的测定，取其平均值作为标本值。在进行蛋白免疫印迹之前，首先提取心肌组织蛋白，并进行蛋白浓度的监测，然后取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，并转膜至PVDF膜上，进行脱脂奶粉的封闭处理，TBST洗膜，加入一抗(TGFβ1体积稀释度1∶2 000)；GAPDH(体积稀释度1∶2 000)，4℃孵育过夜，再次TBST洗膜后加入二抗室温孵育2 h，ECL显色，于全能型ChemiDocMP成像分析系统采集图像，用积分吸光度比值(TGFβ1/GAPDH)作为其相对表达量。

八、 统计学处理

结果

一、 各组大鼠一般情况

假手术组大鼠表现正常，空白组大鼠皮毛不整，活动后出现憋喘，双下肢出现水肿；各用药物组症状较空白组大鼠轻微，灌胃给药结束后空白组大鼠死亡1只，考虑为慢性心力衰竭急性发作。其余组未见死亡。

二、 各组大鼠血流动力学指标监测

与假手术组相比，空白组大鼠中±dp/dtmax显著下降,LVEDP、LVSP明显上升；与空白组相比，黄芪甲苷高、中剂量组LVEDP、LVSP明显下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax显著上升，见表1。

表1±s)

注：与假手术组相比，aP<0.01；与空白组相比，bP<0.01，cP<0.05

三、 各组大鼠HW/BW、LVW/BW比值比较

与假手术组相比，空白组大鼠HW/BW、LVW/BW的比值明显升高，黄芪甲苷组相应比值较空白组有所下降，随着的黄芪甲苷剂量的升高，下降的幅度越大，具有明显的剂量依赖性，见图1。

图1　大鼠HW/BW、LVW/BW比值

四、 各组大鼠心肌组织切片苏木素-伊红染色结果比较

光镜下观察，假手术组中心肌细胞排列整齐、大小匀称、细胞清晰可见。空白组大鼠心肌细胞形态不规则、细胞肥大，胞间存在大量的纤维组织，同时有大量炎性细胞的浸润。黄芪甲苷低、中、高剂量组心肌细胞轻度肥大，细胞排列尚整齐，伴有不同程度的纤维组织的增生，较空白组明显减轻，随着黄芪甲苷的剂量的增加，改善程度增强，见图2。

图2　大鼠心肌组织切片(苏木素-伊红染色，×400)

五、 各组大鼠心肌组织切片Masson染色结果以及CVF比较

在Masson染色中，胶原蛋白被染色为蓝色，心肌细胞染色为暗红色，同假手术组比，空白组CVF的比值明显升高，与空白组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组CVF比值明显的下降，见图3、表2。

图3　大鼠心肌组织切片(Masson染色,×400)

六、 各组大鼠心肌组织免疫组织化学结果比较

TGFβ1主要表达于心肌胞质中，为棕黄色的颗粒，同假手术组相比，空白组中TGFβ1平均积分吸光度值明显增大；同空白组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组中TGFβ1的平均吸光度值显著下降(呈现剂量依赖性)，见图4、表2。

图4　大鼠心肌组织切片免疫组化TGFβ1表达图(×400)

表2±s)

注：与假手术组比较，aP<0.01；与空白组比较，bP<0.01，cP<0.05

七、 各组大鼠心肌组织蛋白免疫印迹法结果

同假手术组相比，空白组中心肌组织TGFβ1因子表达水平明显增强；同空白组相比较，黄芪甲苷低、中、高剂量组心肌组织TGFβ1因子表达水平明显减弱，见图5、表2。

图5　各组心肌组织TGFβ1因子的表达

讨论

在CHF的发生发展的过程中，心室重构、细胞肥大、心肌纤维化等机制发挥着巨大的作用，其中以心肌纤维化的作用更为突出，心力衰竭已经成为21世纪严重威胁老年人生命的心脏疾病之一[5]。TGFβ1是一种由2条多肽链组成的二聚体(25kd)，正常情况下以非活性形式存在于细胞表面以及胞质中，经过纤维蛋白溶解酶溶解，成为活性型TGFβ1，在细胞的生长、分化、免疫调节、细胞外基质合成及损伤后的修复方面发挥着重要作用[6]。TGFβ1 是属于一组调节细胞生长和分化的细胞因子，其能够促成纤维分裂和胶原沉积，与多种器官的纤维化密切相关[7]。既往实验证实TGFβ1不仅能够诱导成纤维细胞增生并向肌成纤维细胞转化，而且促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的高表达[8]。同时TGFβ1能够促进细胞外基质(ECM)的形成，并且能够抑制细胞外基质降解酶的活性，从而达到减少ECM降解的目的[9]。TGFβ1是一种促进心肌纤维化的重要生长因子，在各种原因引起的慢性心力衰竭中均有较高的表达，大量研究发现，在心肌纤维化时，TGFβ1表达增高与Ang Ⅱ的作用密切相关，AngⅡ可通过刺激TGFβ1及其Smads 信号转导通路，进而增加Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的合成，并促进心肌纤维化的发生[10]。既往研究已经证实，CHF大鼠模型心肌组织中的TGFβ1表达明显增强。

黄芪甲苷作为传统的中药黄芪的提取制剂，在治疗心血管疾病方面药理作用广泛，主要表现在抑制心室重构、抑制心肌纤维化、改善心功能、改善能量代谢等方面[11-12]。本研究观察黄芪甲苷不同剂量组与空白组进行比较发现，大鼠心肌组织中TGFβ1 mRNA、TGFβ1的表达都是明显减弱的(P<0.01或P<0.05)，并呈现出黄芪甲苷的剂量依赖性。在心肌组织切片中，黄芪甲苷不同剂量组中的纤维化以及CVF表达为不同程度的下降，也呈现出剂量依赖性，与TGFβ1、TGFβ1 mRNA的表达水平相吻合。血流动力学的监测结果、心肌病理切片、CVF监测等共同支持黄芪甲苷具有保护心功能、抑制心肌纤维化的作用。综上所述，该研究推测黄芪甲苷能够改善CHF大鼠心脏功能，减轻心脏的纤维化程度，可能是与其抑制心肌组织TGFβ1的过度表达有关，并呈现剂量的依赖性，具体机制可能是减少ECM的合成、促进ECM的降解，从而达到抑制心肌纤维化的作用。因此，该实验为黄芪甲苷抑制心肌纤维化、治疗CHF提供新的理论依据，为临床治疗慢性心力衰竭提供一种新的理想药物。由于本研究纳入的样本量相对较少，此结论有待多中心、大样本研究进一步的证实。同时考虑 CHF的发生发展机制错综复杂，CHF与其他多个因子关系密切[12](例如结缔组织生长因子、IL-1、IL-6等)，黄芪甲苷是否通过其他相关因子抑制CHF的进展尚需进一步的研究。

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(本文编辑：杨江瑜)

蒋洪强张金国

【摘要】目的研究黄芪甲苷对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌纤维化和转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响。方法采用腹主动脉缩窄法制作CHF模型，并分为空白组、黄芪甲苷低、中、高剂量(20、40、60 mg/kg)组、缬沙坦(10 mg/kg)组，同时设立假手术组做对照，每日给药(灌胃)1次，持续4周。4周后行血流动力学指标的检测，处死大鼠后计算心脏重量/体质量比(HW/BW)、左心室重量/体质量比(LVW/BW)，常规行苏木素-伊红染色观察心肌组织形态学变化，Masson染色观察心肌纤维化，测量胶原容积分数(CVF)，RT-PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹法检测TGFβ1 mRNA以及TGFβ1分子表达水平。结果同空白组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组HW/BW、LVW/BW、CVF、TGFβ1 mRNA、TGFβ1等表达明显减弱(P<0.05)，黄芪甲苷中、高剂量组左心室舒张末压、左心室收缩压显著下降，±dp/dtmax显著上升(P<0.05)，细胞形态明显改善。结论黄芪甲苷能够抑制CHF大鼠的心肌纤维化，具体作用机制可能是通过抑制心肌组织中TGFβ1的过度表达来实现的。

【关键词】黄芪甲苷；慢性心衰；转化生长因子β1；心肌纤维化

Inhibition of astragaloside IV on myocardial fibrosis and expression of myocardial transforming growth factor β1 in rats with chronic heart failureJiangHongqiang,ZhangJinguo.AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining272092,China

Correspondingauthor,ZhangJinguo,E-mail:cck112000@aliyun.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of astragaloside IV on myocardial fibrosis and expression of myocardial transforming growth factor (TGFβ1) in rats with chronic heart failure(CHF). MethodsThe rat model of CHF was induced by abdominal aorta constriction. Experiments were carried out in the following groups: sham operation group, blank group, astragaloside IV low, medium and high dose group (20, 40, 60 mg/kg), valsartan group (10 mg/kg). The rats in those groups were daily administrated with corresponding drugs for 4 weeks, and then hemodynamic indexes were monitored. After the rats were executed, HW/BW and LVW/BW were measured. Further, conventional HE staining was performed to observe the morphologic changes of myocardial tissue; Masson staining was used to observe myocardial fibrosis and measure collagen volume fraction; and RT-PCR, immunohistochemistry and Western-blotting were used to monitor the expression level of TGFβ1 mRNA and TGFβ1. ResultsCompared with the blank group, HW/BW,LVW/BW,collagen volume fraction(CVF) and the expression level of TGFβ1 mRNA and TGFβ1 were obviously reduced in astragaloside IV low, medium and high dose group (P<0.05), and in astragaloside IV medium and high dose group left ventricular end-diastolic pressure and left ventricular systolic pressure were dramatically reduced with dramatically increased ±dp/dtmax (P<0.05) and obviously improved cytology morphology. ConclusionsAstragaloside IV can inhibit myocardial fibrosis in rats with CHF through a possible mechanism involving the inhibition of myocardial TGFβ1 expression by astragaloside IV.

【Key words】Astragaloside IV; Chronic heart failure;Transforming growth factor β1;

收稿日期：(2015-08-06)

通讯作者，张金国，E-mail:cck112000@aliyun.com

基金项目：山东省中医药科学技术研究项目(2013-235)；山东省高校优秀科研创新团队计划资助

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.006