脑休眠灌注唤醒实验研究

叶利斌，花爱远，代 波，卢婷婷，叶美麟

·论著·

脑休眠灌注唤醒实验研究

叶利斌，花爱远，代 波，卢婷婷，叶美麟

【摘要】目的探究兔脑休眠灌注唤醒的机制及其与脑死亡的关系。方法2010年9月—2014年9月选取健康新西兰白兔36只，按随机数字表法均分6组(A～F组，各6只)，按可控性兔全脑缺血实验模型的方法造模，分别比较全脑缺血后的传统复苏及全脑缺血后分别用自配的脑保护液、5%葡萄糖溶液及兔血浆等灌注唤醒大脑的效果；利用MS-2000计算机生物信号记录分析系统全程检测兔的呼吸、心率、血压及脑电；目测实验兔的自主运动、对刺激的反应及脑部水肿等，记录6组兔的生存率。另选取健康新西兰白兔6只，分别提取其抗凝血浆及脑、肝、心、肾等组织浸液，用试管法比较脑、肝、心、肾浸液对血液凝固时间的影响(1～5管)。结果A、C、D组兔均不能恢复自主呼吸而死亡；B组兔均反射恢复而生存；E组兔1只不能恢复自主呼吸而死亡，其余5只反射恢复而生存；F组兔3只不能恢复自主呼吸而死亡，其余3只反射恢复而生存。6组兔生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；B、E组兔生存率高于A、C、D组(P<0.003 3)。五管血液凝固时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。2、3、4、5管血液凝固时间长于1管(P<0.05)；3、4、5管血液凝固时间长于2管(P<0.05)；4管血液凝固时间短于3管，5管血液凝固时间长于3管(P<0.05)；5管血液凝固时间长于4管(P<0.05)。结论自主研发的脑保护液可有效防止兔大脑停止供血后迅速发生的脑水肿及血液凝固，使脑休眠期延长达60 min,为临床进一步研究提供了参考依据。

长期以来均认为，大脑对缺血缺氧敏感，停止供血3～5 min就可出现不可逆死亡。美国的脑死亡实验室诊断金标准是4条脑血管(颈总动脉和椎动脉)造影无血流灌注和脑电出现平直等[1-4]。然而，最近的研究发现，大脑停止供血、脑电变平直、功能丧失等并非脑死亡，而是脑细胞在停止供血，内环境改变后处于的休眠状态，当内环境条件恢复后，脑细胞会重新觉醒并执行其功能[5-6]，并在国际上首先提出了脑休眠概念[7]：大脑完全性缺血缺氧后的功能休止状态称为脑休眠(cerebral dormancy)，脑休眠开始至能被唤醒的时间称为休眠期，休眠期后大脑功能不可逆终止称为脑死亡。本研究通过比较不同灌注液对脑休眠灌注唤醒的效果及脑、肝、心、肾等组织浸液对血液凝固速度的影响，以进一步弄清脑休眠灌注唤醒的机制，找出脑休眠唤醒的有效方法。

1材料与方法

1.1不同灌注液对脑休眠灌注唤醒的效果用自创的可控性兔全脑缺血实验模型[8]的方法造模，分别比较全脑缺血后的传统复苏及全脑缺血后分别用自配的脑保护液、5%葡萄糖溶液及兔血浆等灌注唤醒大脑的效果。

1.1.1实验材料

1.1.1.1实验动物2010年9月—2014年9月选取健康新西兰白兔36只，雌雄不限，体质量3.0～3.5 kg，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.1.1.2实验仪器和药品MS-2000计算机生物信号记录分析系统，压力换能器，按钉式引导电极，深动脉血流阻断套管，三通、四通动脉导管，动物手术器械，照明灯，兔台，地西泮针剂，1%肝素，兔血浆，5%葡萄糖溶液，脑保护液(自主配方)：100 ml中含氯化钠0.375 g、乳酸钠0.077 5 g、氯化钾0.007 5 g、氯化钙0.005 g、葡萄糖2.5 g、右旋糖酐(40)7.5 g等。

1.1.2方法

1.1.2.1动物分组及造模将兔按完全随机数字表法分为A、B、C、D、E、F组共6组，每组6只。A组全脑缺血7.5 min，不做脑部灌注；B组全脑缺血15 min，脑部灌注脑保护液；C组全脑缺血15 min，脑部灌注5%葡萄糖溶液；D组全脑缺血15 min，脑部灌注兔血浆；E组全脑缺血30 min，脑部灌注脑保护液；F组全脑缺血60 min，脑部灌注脑保护液。

本研究创新点：

首先提出了脑休眠的概念，证明大脑可耐受完全性缺血的时间达60 min以上。

论证了脑休眠唤醒的关键是有效阻止休眠期脑部迅速发生的脑水肿及血液凝固。

1.1.2.2实验准备MS-2000计算机生物信号记录分析系统的准备：将脑电引导电极的输入线连接上按钉式引导电极，插入一通道插口；将血压换能器注满1%肝素后，插入二通道插口。启动MS-2000系统，进入监视状态。参数设置：将第一通道输入选择“脑电”，增益为1/16 mv/cm；将第二通道输入选择“压力”，增益为1/8档处；选择连续示波显示，扫描基线调到适当位置。

动物手术准备：用地西泮针剂以10 mg/kg的剂量静脉麻醉后将兔固定在手术台上。剪去颈部的毛，沿正中线作6～8 cm长的皮肤和皮下组织切口，钝性分离肌肉，暴露气管、动脉。

分离两侧椎动脉，套上深动脉血流阻断套管：用止血钳于锁骨水平，沿一侧颈总动脉外逐层分离颈筋膜，直至椎前层筋膜。在椎动脉始段搏动明显处用止血钳钝性分离椎前层筋膜，暴露椎动脉，用眼科弯镊小心在椎动脉下方穿过，并将一根丝线在动脉下方带出，后用两根引线把丝线两端带过深动脉血流阻断套管并套牢，以备结扎阻断椎动脉用。同法分离另一侧椎动脉。

分离两侧颈总动脉，连接三通、四通动脉导管：用止血钳在气管旁钝性游离一侧颈总动脉，动脉下方穿两根丝线备用，颈总动脉的两端(间隔3 cm以上)分别用动脉夹夹闭后于中间剪开两端，将四通动脉导管(注满1%肝素)两端分别插入颈总动脉两端并用丝线固定。四通动脉导管近头端的侧口接输液管，近心端的侧口接血压传感器，开通阀门使血压传感器与心端血管相通，打开动脉夹检测动脉血压。用同法将三通动脉导管的两端插入并连接另一侧的颈总动脉，侧口接输液管，开通颈总动脉血流。

连接脑电引导电极：在兔头顶部切开皮肤暴露颅骨，在矢状缝旁2～3 mm、人字缝前5～6 mm处，用锥钻刺一小孔，接入按钉式引导电极，参考电极位于皮肤切口，监测脑电活动。

1.1.2.3实验方法A组利用深动脉血流阻断套管结扎椎动脉，同时关闭颈总动脉上的阀门，从而阻断两侧椎动脉和颈总动脉的血流造成兔全脑缺血。B组用和A组相同的方法造成兔全脑缺血后，随之打开两侧颈总动脉输液管阀门，让脑保护液以60滴/min的速度从两侧颈总动脉缓慢注入大脑。C组用和B组相同的方法，并用5%葡萄糖溶液代替脑保护液灌注大脑。D组用和B组相同的方法，并用兔血浆代替脑保护液灌注大脑。E组用和B组相同的方法，且脑保护液灌注的时间从15 min延长至30 min。F组用和B组相同的方法，并将脑保护液灌注的时间从15 min延长至60 min。

1.1.3检测指标利用MS-2000计算机生物信号记录分析系统全程检测兔的呼吸、心率、血压及脑电；目测实验兔的自主运动、对刺激的反应及脑部水肿等。记录6组兔的生存率。

1.2脑、肝、心、肾等组织浸液对血液凝固时间的影响

1.2.1实验材料

1.2.1.1实验动物健康新西兰白兔6只，雌雄不限，平均体质量2.0 kg，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2.1.2实验仪器和药品2 ml试管30支，50 ml烧杯10个，1 ml吸管20支，试管架，地西泮针剂，0.1 mol/L枸橼酸钠溶液，1/40 mol/L氯化钙溶液，0.9% 氯化钠溶液，秒表，兔台，乳钵等。

1.2.2方法

1.2.2.1抗凝血浆及脑、肝、心、肾等组织浸液制备兔常规麻醉后行颈部手术，颈动脉放血50 ml进入盛有0.1 mol/L枸橼酸钠的烧杯内(一份抗凝剂加9份全血)，摇匀后以1 000 r/min离心10 min(离心半径13.5 cm)，取上层为枸橼酸血浆备用。手术取出兔的适量脑、肝、心、肾组织，分别置乳钵中研碎后，以1 g组织加10 ml 0.9% 氯化钠溶液的比例混匀成组织悬液，分别以1 000 r/min离心8 min(离心半径13.5 cm)取上清液即为脑浸液、肝浸液、心浸液、肾浸液等备用。

1.2.2.2各管加入成分取2 ml试管5支，标号(1管、2管、3管、4管、5管)后置试管架上，各管均加入同一兔的枸橼酸血浆0.6 ml，随后在1管、2管、3管、4管、5管内分别加入该兔的脑浸液、肝浸液、心浸液、肾浸液及0.9% 氯化钠溶液各0.2 ml并摇匀，在以上五管溶液中同时各加入1/40 mol/L氯化钙溶液0.2 ml后开始计时，并迅速摇匀，之后每10 s倾斜试管一次，分别记录各试管血液凝固时间。6只兔均重复上述操作。记录各管血液凝固时间的均值。

2结果

2.1不同灌注液对脑休眠灌注唤醒的效果

2.1.1A、B、C、D、E、F组实验结果A组兔均在全脑缺血10～15 s内自主呼吸停止，13～18 s内脑电逐渐消失，1～2 min内血压反应性增高，随后血压迅速下降，呈休克状态；给予人工胸外按压抢救，并于阻断脑血流7.5 min后开通所有被关闭的血管继续抢救，但均不能恢复自主呼吸而死亡；10 min内对死亡兔进行开颅观察，发现兔的脑外观均表现为体积增大膨出，脑膜紧张，表面颜色暗红，血管模糊，脑回扁平而宽，脑沟变浅及脑室腔变窄等脑水肿及淤血征象。B组兔的呼吸、血压一直保持平稳，而脑电在阻断脑血流15～20 s内逐渐消失；15 min后，停止脑保护液灌注，开通两侧颈总动脉和椎动脉血流：兔的血压、呼吸均继续保持平稳，脑电活动逐渐恢复，待麻醉作用过后，兔均能爬起行走，反射恢复而生存；2 h后开颅活体观察，兔的脑外观正常，供血良好。C组兔在灌注过程中均无法维持呼吸、血压平稳，只能给予人工胸外按压维持生命体征；15 min后，停止5%葡萄糖溶液灌注，并开通颈总动脉和椎动脉血流：兔均不能恢复自主呼吸而死亡；开颅观察兔的脑外观与A组相同。D组兔在灌注过程中均无法维持呼吸、血压平稳，只能给予人工胸外按压维持生命体征；15 min后，停止兔血浆灌注，并开通颈总动脉和椎动脉血流：兔也均不能恢复自主呼吸而死亡；开颅观察兔的脑外观与A组相同。E组兔有5只血压、呼吸一直能自主维持平稳，开通两侧颈总动脉和椎动脉血流后，脑电活动逐渐恢复，待麻醉作用过后，能爬起行走，反射恢复而生存；另1只因不能恢复自主呼吸而死亡；2 h后对存活兔开颅活体观察，脑外观正常，供血良好。F组兔3只血压、呼吸能自主维持平稳，开通两侧颈总动脉和椎动脉血流后，脑电活动也逐渐恢复，待麻醉药作用过后，能爬起行走，反射恢复而生存；另3只因不能恢复自主呼吸而死亡；2 h后对存活兔开颅活体观察，脑外观正常，供血良好。

2.1.2A、B、C、D、E、F组兔生存率比较6组兔生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B、E组兔生存率高于A、C、D组兔生存率，差异有统计学意义(P<0.003 3，见表1)。

表1　A、B、C、D、E、F组生存率的比较〔n(%)〕

注：与A组比较，aP<0.003 3；与B组比较，bP<0.003 3；与C组比较，cP<0.003 3；与D组比较，dP<0.003 3

2.2脑、肝、心、肾浸液对血液凝固时间的影响五管血液凝固时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。2、3、4、5管血液凝固时间长于1管，差异均有统计学意义(P<0.05)。3、4、5管血液凝固时间长于2管，差异均有统计学意义(P<0.05)。4管血液凝固时间短于3管，5管血液凝固时间长于3管，差异均有统计学意义(P<0.05)。5管血液凝固时间长于4管，差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2　各管血液凝固时间比较±s，s)

注：与1管比较，aP<0.05；与2管比较，bP<0.05；与3管比较，cP<0.05；与4管比较，dP<0.05

3讨论

本研究采用自配的脑保护液，其主要成分是右旋糖酐，其分子量与血浆清蛋白相近，能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外水分；使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性；抑制凝血因子Ⅱ的激活，使凝血因子Ⅰ和Ⅷ活性降低及其抗血小板作用均可防止血栓形成[9-10]。该液的晶体渗透压与血浆相等，不影响细胞膜内外的水分交换，可防止细胞内水肿，而胶体渗透压高达正常血浆的2倍以上，具有较强阻止组织液生成作用，能有效阻止脑组织缺血缺氧后产生的快速吸水效应，并具有抗凝作用。所以该脑保护液灌注大脑能明显延长脑休眠期，最长达60 min以上。而C组和D组分别用5% 葡萄糖溶液(无胶体压)和血浆(胶体压正常)灌注大脑，因不能有效对抗脑组织缺血缺氧后形成的快速吸水效应，也无抗凝作用，所以这两组兔均出现脑水肿、脑淤血而死亡。

本研究对全脑缺血再灌注后死亡的兔进行开颅观察，发现这些兔均很快就出现明显脑水肿外观，而全脑缺血不做脑部灌注死亡的兔却没有明显脑水肿表现。说明大脑停止供血后，脑组织出现了特有的快速主动吸水效应，当脑部再灌注时这一吸水效应引起组织液快速生成，迅速发生脑水肿。其结果，一方面使脑部血液浓缩，黏度增高，血流阻力增大，另一方面使脑组织静水压增大，脑压增高，造成脑血管受压，口径变小等，加速脑血流淤滞，导致再灌注受阻。同时，本研究在脑、肝、心、肾等组织浸液对血液凝固时间的影响中发现，同样条件下血液在脑部发生凝固的时间明显比在肝、心、肾等组织中短，加上脑组织缺血再灌注时的主动吸水效应造成的血液黏度增高、血流淤滞等进一步加快血凝等，这些均可进一步加重脑血流淤堵，形成恶性循环。可见，脑部水肿及血液凝固的发生是全脑缺血再灌注后加快脑死亡的主要原因。然而，脑停止供血后，为什么会形成脑部特有的快速吸水效应？脑部的血液凝固时间为什么比其他部位短？还有待进一步研究。

1985年人们开始做脑缺血再灌注损伤的基础研究并发现自由基[11]，普遍认为脑再灌注损伤与自由基、钙超载、兴奋性氨基酸、一氧化氮、炎性反应及细胞凋亡等有关[12-17]。用兔进行全脑缺血再灌注的研究报道不多，这些研究报道也多针对以上机制进行[18-22]。本研究是在兔全脑缺血状态下用脑保护液持续灌注大脑，其方法和手段均是独特的，实验结果不支持上述观点，认为引起脑缺血再灌注损伤的主要原因应该是快速形成的脑水肿、血液凝固等造成的脑血流淤堵。临床上应用甘露醇[23-24]、疏通血管药物[25]及抗血小板[26]、抗凝[27]等药物治疗脑缺血性疾病有效也说明了这一问题。能否利用导管介入等手段，将具有高胶体渗透压及抗血凝作用的药物直接注入缺血的大脑或缺血灶，以便更有效地用于脑复苏及脑梗死等缺血性疾病的治疗还有待进一步的临床研究。另外，本研究发现，大脑停止供血后很快出现功能停止、脑电消失，同时脑干功能也受到严重影响(呼吸停止，血压波动大等)，但当灌注脑保护液后脑干功能却可单独恢复正常，其原因也有待进一步研究。

脑缺血性疾病是严重影响人类生存质量与寿命的疾病，是临床研究的热点，缺血可导致脑结构及功能的损害，脑组织损害程度与缺血时间长短及残存血流量多少相关。短期、不完全性缺血引起可逆性损害，长时间、完全性缺血会引起不可逆损伤。临床上尽早恢复脑组织血液再灌注，将有效减轻脑缺血损伤。长期以来，人们对脑缺血诱导的再灌注损伤机制的认识众说纷纭[28-32]，认为过氧化物、细胞内钙超载、一氧化氮失调控、兴奋性氨基酸毒性、蛋白代谢异常、炎性反应及细胞凋亡等与脑缺血再灌注损伤有关，彼此构成一个相互促进的复杂网络。尤其是完全性脑缺血后导致脑功能停止(脑休眠)，不易用常规方法逆转，造成全脑缺血后很快死亡的假象，认为大脑对缺氧缺血敏感，停止供血3～5 min就可出现不可逆死亡。然而，本研究证明大脑停止供血后功能丧失、脑电活动停止，只是脑细胞缺血缺氧后表现出的休眠状态，并非脑死亡，当恢复供血后，脑细胞会被唤醒并重新执行其功能。脑被唤醒的关键是恢复脑供血，其关键是有效防止脑水肿及血液凝固的发生。并证明脑耐受完全缺血的时间(脑休眠期)达60 min以上。另外，在脑片神经元电活动的记录实验中也看到，脑片离体数小时后神经元仍然有活性，说明大脑对缺血缺氧的耐受性很强[33-35]。

综上所述，脑休眠是大脑停止供血后出现的功能暂时缺失状态，有效的方法可以逆转这一状态。自主研发的脑保护液可有效防止兔大脑停止供血后迅速发生的脑水肿及血液凝固，使脑休眠期延长达60 min，但有必要进一步过度到人体临床研究得以完善并利用。大脑停止供血后的快速吸水效应及快速血液凝固的深层次原因也有待深入研究，大脑停止供血3～5 min并非发生脑死亡而是处于脑休眠期，脑死亡的标准应重新审视。

作者贡献：叶利斌对课题总负责与课题实施；花爱远参与实验实施与动物模型研究；代波、卢婷婷、叶美麟参与实验实施。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：李婷婷)

【关键词】脑死亡；脑休眠；再灌注；唤醒；脑保护液

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Study of Awakening Rabbit Cerebral Dormancy by PerfusionYELi-bin,HUAAi-yuan,DAIBo,etal.RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of awakening rabbit cerebral dormancy by perfusion and its relationship with brain death.MethodsThe study selected 36 healthy New Zealand white rabbits from september 2010 to 2014.Using random number table method,we divided them into 6 groups(group A-F) with 6 rabbits in each group.Controllable whole brain ischemia experiment models were built,and comparison was made among the awakening effects of conventional resuscitation,self-formulated rabbit cerebral protective fluid,5% glucose solution and rabbit plasma.By MS-2000 computer biological signal system,we recorded and analyzed breath,heart rate,blood pressure and electroencephalogram of the rabbits during the whole intervention.Autokinetic movement,response to stimulation and brain edema were observed.The survival rates of the 6 groups were recorded.We selected 6 healthy New Zealand white rabbits and obtained their anticoagulant plasma and tissue extracts of brain,liver,heart and kidney.Using tube method,we compared the influences of brain,liver,heart and kidney extracts on blood coagulation time.ResultsThe rabbits of group A,group C and group D all died because of the irreparability of autonomous respiration;the rabbits of group B all recovered reflection and survived;1 rabbit in group E died because of the irreparability of autonomous respiration,and the rest 5 rabbits recovered reflection and survived;3 rabbits in group F died due to the irreparability of autonomous respiration,and the rest 3 rabbits recovered reflection and survived.The 6 groups were significantly different in survival rate(P<0.05).Group B,group E were higher than group A，group C,group D in survival rate(P<0.05).The five tubes of blood were significantly different in coagulation time (P<0.05).Tube 2,tube 3,tube 4 and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 1(P<0.05);tube 3,tube 4 and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 2 (P<0.05),tube 4 had shorter blood coagulation time than tube 3 (P<0.05),and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 3(P<0.05);tube 5 had longer blood coagulation time than tube 4(P<0.05).ConclusionThe self-developed cerebral protective fluid can effectively prevent cerebral edema and blood coagulation that occur rapidly after the halt of cerebral blood supply,with the cerebral dormancy prolonging 60 minutes.The study may provide references for further clinical research.

【Key words】Brain death；Cerebral dormancy；Reperfusion；Waking up；Cerebral protective solution

(收稿日期：2015-06-20；修回日期：2015-10-11)

【中图分类号】R 331.373

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.014

通信作者：叶利斌，530011广西南宁市，广西中医药大学附属瑞康医院；E-mail:gxyelibin@sina.com

基金项目：广西中医药大学课题 (P2010092)
作者单位：530011广西南宁市，广西中医药大学附属瑞康医院(叶利斌，花爱远，卢婷婷，叶美麟)；广西中医药大学第一附属医院(代波)