血小板衍化生长因子-D基因多态性与冠状动脉粥样斑块的相关性

刘相飞　高　静　陈玉东

(胜利油田中心医院心内科，山东　东营　257034)



血小板衍化生长因子-D基因多态性与冠状动脉粥样斑块的相关性

刘相飞高静陈玉东

(胜利油田中心医院心内科，山东东营257034)

摘要〔〕目的探讨血小板衍化生长因子(PDGF)-D rs7950273位点基因多态性与冠状动脉粥样硬化斑块性质的相关性。方法237例冠心病(CHD)患者根据冠脉造影及血管内超声检查(IVUS)结果将粥样斑块分为稳定斑块组(65例)、易损斑块组(89例)、混合斑块组(83例),采用聚合酶链反应(PCR)技术检测PDGF-D rs7950273基因多态性及测序鉴定，并选择112例正常者为对照。结果CHD组(62 例,26.2%)CC基因型频率显著高于对照组(16 例,14.2%),而对照组GG基因(39例,34.8%)高于CHD组(43例,18.1%)。CHD组C等位基因频率(256例,54.1%)明显高于对照组(89 例,39.7%)。CHD亚组间基因频率分布特点为稳定斑块组与易损斑块组、混合斑块组差异显著(P<0.05)。结论PDGF-D rs7950273位点基因多态性与冠状动脉粥样硬化斑块性质的相关,C 等位基因使易损斑块的发生率增加。

关键词〔〕冠状动脉粥样硬化斑块;基因多态性;血小板衍化生长因子(PDGF)-D rs7950273

第一作者：刘相飞(1981-)，男，硕士，主要从事冠心病、心律失常介入治疗研究。

血小板衍化生长因子(PDGF)是体内一种较强的促细胞增长调节因子，其分子量约为28～35 kD的阳离子糖蛋白，可由血小板、成纤维细胞、血管内皮细胞、单核巨噬细胞等多种细胞产生和释放，与机体组织的新陈代谢、冠状动脉粥样硬化的发生发展密切相关。冠心病(CHD)发病机制极其复杂，而冠状动脉粥样硬化(AS)斑块破裂和血栓成为导致主要心血管事件的病理基础，而如何提前预测斑块的性质已成为当前的研究热点。近年来,PDGF-D在AS发生和斑块稳定性中的作用日益引起医学界的高度重视〔1〕。本研究将从分子生物学水平阐述PDGF-D rs7950273位点基因多态性是否与粥样斑块血管内超声(IVUS)显像特征相关。

1资料与方法

1.1一般资料2010年6月至2014年5月我院心内科住院并行冠脉造影+IVUS检查的237例患者。依据冠脉造影+IVUS结果分组：①稳定斑块组：65例，男43例，女22例，平均年龄(62.1±9.3)岁；②易损斑块组：89例，男58例，女31例，平均年龄(62.9±10.3)岁；③混合斑块组：83例，男57例，女26例，平均年龄(61.5±9.4)岁；另选取体检健康者为对照组：112例，男75例，女37例，平均年龄(61.9±9.6)岁。四组年龄、性别、吸烟比例、高血压比例、糖尿病比例、甘油三酯及胆固醇均无统计学差异(P>0.05)。见表1。根据病史及辅助检查排除各种感染性疾病、肿瘤、结核、肝肾疾病、结缔组织病、甲状腺疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等。

表1　各组一般资料及实验室数据指标±s)

1.2方法①基因组DNA的提取。均于入院后抽取3 ml静脉血，应用乙二胺四乙酸抗凝管，分离白细胞，应用低渗溶血法提取基因组DNA。②引物设计与合成。采用Oligo 6.0软件设计引物，由中国奥科生物公司合成。PDGF-D rs7950273位点上游引物5'-GCCACATTTAGCCATTCT-3'；下游引物5'-TGTTGGGATGAAGAAAGG-3'。③基因型检测。首先采用PCR方法扩增包含PDGF-D基因rs7950273位点的目的基因DNA片段。然后将PCR扩增产物应用限制性内切酶(BsmAⅠ)进行酶切，随后应用 3.5%琼脂糖凝胶检测，最后应用凝胶成像仪拍照后确定基因型。将PCR扩增产物随机抽取，委托深圳华大基因公司采用Sanger法进行基因测序。

1.3统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行t、χ2检验。

2结果

2.1PDGF-D rs7950273基因型检测结果rs7950273位点PCR扩增产物出现3种基因型：CC基因型(320 bp 1条带)，GG基因型(192、128 bp 2条带)，杂合子CG基因型(320、192、128 bp 3条带)，见图1。基因测序结果与酶切结果完全一致。见图2。

2.2基因多态性分布特点 PDGF-D rs7950273位点的等位基因频率在CHD各亚组和对照组的分布特点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)。CHD组CC基因型频率显著高于对照组,而对照组GG基因高于CHD组。CHD组C 等位基因高于对照组(P<0.05)。稳定斑块组与易损斑块组、混合斑块组差异显著(P<0.05)，易损斑块组与混合斑块组差异不显著(P>0.05)。见表2。

1、3为CC基因型；2、5为GG型；4、6为CG型；M.Marker图1　酶切后3.5%琼脂糖凝胶电泳图

图2　基因型测序图

组别n等位基因频率CG基因型频率CCCGGGCHD组237256(54.1)1)218(45.9)1)62(26.2)1)132(55.7)1)43(18.1)1)稳定斑块组6556(43.1)2)74(56.9)2)9(13.8)2)38(58.5)2)19(27.7)2)易损斑块组89102(57.4)76(42.6)28(31.5)46(51.7)15(16.9)混合斑块组8395(57.2)71(42.8)26(31.3)43(51.8)14(16.9)对照组11289(39.7)135(60.3)16(14.2)57(50.9)39(34.8)

与对照组比较：1)P<0.05；与易损斑块组、混合斑块组比较：2)P<0.05

3讨论

PDGF是血管内皮生长因子家族成员之一，包括5中形式：PDGF-A、-B、-AB、-C、-D，其中D链基因位于11q22染色体上。CHD是由多个基因及环境因素相互作用所致的常见复杂性疾病。“常见疾病、多个易感基因、微效作用”理论提出个体的易感基因遗传变异可能显著增加CHD发病率。遗传度大于20%的表型具有明显的遗传倾向，流行病学研究也证实CHD患者多数存在家族聚集性〔2〕。近年来，CHD遗传学方面研究致力于寻找AS的遗传致病/易感基因，确定这些致病/易感基因是否有利于确定干预靶点和早期危险识别。

在AS发生发展过程中，各种原因所致损伤的内皮细胞、血小板及激活的单核巨噬细胞都能以自分泌和旁分泌释放PDGF，并在斑块表面过度表达，而PDGF作为一种平滑肌细胞的趋化因子，除促进平滑肌细胞在AS发展过程中不断积聚外，还可与相应的受体结合促进泡沫细胞形成，进一步促进细胞内脂质聚集和细胞外基质沉积〔3～5〕。AS斑块可分为稳定斑块和不稳定斑块，后者又称为易损斑块。研究发现，人类的易损斑块包括多种病理类型，其中最常见的病理性类型为富含炎症的薄帽的纤维粥样斑块(TCFA)〔6〕，其主要特征包括大的脂质核(占斑块面积的25%)、薄的纤维帽(<65 μm)，斑块内富含巨噬细胞和T淋巴细胞、基质成分和平滑肌细胞减少和正性重构等〔7〕。近期有关易损斑块动物模型与急性冠脉综合征患者的研究〔8〕发现，炎症免疫机制、增殖凋亡机制、损伤应激机制及生物力学机制参与了AS斑块的发生、发展过程。IVUS可根据斑块的回声特点判断其性质，目前IVUS导管系统可以产生灰阶IVUS和虚拟组织学(VH)-IVUS。VH-IVUS将识别富含脂质坏死核的敏感性和特异性提高到91.7%和96.6%〔9〕。近期有关VH-IVUS的PROSPECT研究结果表明，通过VH-IVUS技术所确定的易损斑块可以预测CHD患者主要心血管事件的发生率〔10,11〕。本研究提示C等位基因使得CHD的发生率明显提高。PDGF-Drs7950273位点的基因多态性与易损斑块直接相关，究其具体机制可能与C等位基因干预了PDGF-Drs7950273 蛋白翻译效率,影响PDGF-D的表达有关。

综上,PDGF-D基因的rs7950273的基因多态性与冠状动脉粥样斑块的IVUS显像特征密切相关。新近研究〔12〕表明Trapidil和钙离子阻滞剂可分别通过抑制PDGF受体磷酸化和PDGF介导的血管平滑肌细胞增生阻止AS发生，减小内膜斑块面积。随着分子心脏病学的深入研究，相信从分子水平进行干预AS斑块的治疗策略将在未来实现。

参考文献4

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12Ozawa T,Brennan CW,Wang L,etal.PDGFRA gene rearrangements are frequent genetic events in PDGFRA-amplified glioblastomas〔J〕.Genes Develop,2010;24(19):2205-18.

〔2014-12-09修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者：高静(1979-)，女，博士，副教授，主要从事冠心病、高血压研究。

基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目(No.2011HW075)

中图分类号〔〕R541〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0073-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.031