大肠癌中heregulin、表皮生长因子受体-2及基质金属蛋白酶-7表达及相关性

王冬芽　周　青

(井冈山大学附属医院普外科，江西　吉安　343000)



大肠癌中heregulin、表皮生长因子受体-2及基质金属蛋白酶-7表达及相关性

王冬芽周青1

(井冈山大学附属医院普外科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的探讨heregulin、表皮生长因子受体(ErbB)-2及基质金属蛋白酶(MMP)-7在大肠癌中蛋白和基因的表达及其相关性。方法收集47例大肠癌根治术后新鲜标本为研究对象，用Western印迹法检测heregulin、ErbB-2及MMP-7在肠癌组织、癌旁组织及远癌组织的蛋白表达,用RT-PCR法检测ErbB-2及MMP-7在三组的mRNA表达；比较分析三者与大肠癌临床病理特征的关系。 结果heregulin和ErbB-2在肠癌组织的蛋白表达较癌旁组织显著增多(P<0.01)，而癌旁组织比远癌组织的表达也有所增加(P<0.05)。MMP-7在肠癌组织的表达较癌旁组织增多，差异显著(P<0.01)，远癌组织未见表达；肠癌组织中heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表达两两之间存在正相关关系。ErbB-2在肠癌组织的mRNA表达显著高于远癌组织(P<0.05)；MMP-7的mRNA表达在肠癌组织显著高于癌旁组织(P<0.01)，远癌组织未见表达。heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表达与大肠癌的分级、Dukes分期和淋巴结转移存在相关性。 结论heregulin、ErbB-2及MMP-7在大肠癌中过度表达；heregulin磷酸化激活ErbB-2后可能通过复杂的下游信号通路介导MMP-7表达上调，三者共同在大肠癌的浸润侵袭中发挥重要作用；heregulin及ErbB-2 有望成为判断大肠癌恶性进展的重要指标。

关键词〔〕大肠癌；heregulin；表皮生长因子受体2；基质金属蛋白酶-7

1井冈山大学医学院病理教研室

在我国，随着人口老龄化、饮食结构及生活习惯的改变，大肠癌的发病率逐年上升〔1〕。众多研究表明，表皮生长因子及其受体家族在大肠癌进展中发挥着极其重要的作用。表皮生长因子受体2(ErbB-2)是表皮生长因子受体(EGFR)家族的中心成员，在多种恶性肿瘤进展中起到关键作用〔2～7〕。heregulin是新近发现的表皮生长因子(EGF)家族成员〔8〕，它能专一激活乳腺癌中ErbB-2酪氨酸残基的磷酸化，启动系列细胞应答，促进癌细胞的增殖和浸润〔9～12〕。然而heregulin与ErbB-2在大肠癌中表达的相关性及其意义目前研究甚少。基质金属蛋白酶(MMP)-7具有强大的基质降解功能，是肿瘤恶性侵袭行为的关键因素之一〔13，14〕。本研究heregulin、ErbB-2及MMP-7在大肠癌中的蛋白和基因表达，探讨三者表达的相关性，同时分析三者大肠癌组织学类型、分化程度及Dukes分期等病理学参数之间的关系，以探讨大肠癌浸润和转移的发生机制。

1材料与方法

1.1一般资料选取我院大肠癌根治术后的新鲜大肠癌组织标本，分为：①大肠癌组47例，男25例，女22例，年龄30～79岁，中位年龄53岁。同时收集患者的临床资料，包括组织学分型、分化程度、Dukes分期、有无淋巴结转移等。②癌旁组织组20例，取上述癌肿患者毗邻肿瘤旁的肠黏膜组织。③远癌组织组12例，取上述癌肿患者肿瘤旁10 cm以外的肠黏膜组织。后二组经病理证实均无肿瘤浸润。

1.2Western印迹法检测蛋白质表达取样品与5×上样缓冲液混合煮沸5 min 后上样进行SDS- PAGE电泳；电泳后以稳定18V电压,半干法电转移至PVDF 膜,用含5%脱脂奶粉TBS/T 缓冲液封闭1 h，加入一抗,4℃过夜,洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h,暗室中ECL发光液覆盖膜5 min,X 光胶片曝光,显影,定影，PVDF膜上特异性条带经Olympus BX41凝胶成像仪扫描进行相对定量。

1.3逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测基因表达按EZ Spin Column RNA Purification Kit说明提取总RNA。核酸蛋白分析仪鉴定RNA样品的浓度和纯度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9-2.0。以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA。反应结束后取出cDNA按1∶1稀释，4℃保存。用于real time PCR的两对引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中ErbB-2的引物序列为：上游引物：CCTCTGACGTCCATCATCTC，下游引物：ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT；MMP-7的引物序列为：上游引物：TCTTTGGCCTACCTATAACTGG，下游引物：CTAGACTGCTACCATCCGTC。经由40个循环的变性、退火和延伸，生成的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析，结果用靶基因/β-actin比值表示。

1.4统计学分析采用SPSS11.5统计分析软件行方差分析和Pearson相关分析。

2结果

2.1heregulin、ErbB-2及MMP-7在各组的蛋白表达heregulin和ErbB-2在肠癌组织组的表达比癌旁组织组显著增强，癌旁组织组又比远癌组织组明显增多(图1、表1、表2)。MMP-7在肠癌组织组表达较癌旁组织组显著增加，远癌组织未见表达(图1、表3)。

2.2ErbB-2及MMP-7在各组的mRNA表达 ErbB-2在肠癌组织组的mRNA表达显著高于远癌组织组，此外癌旁组织组比远癌组织组的表达有所增多，但差异无统计学意义(图2,表4)；MMP-7的mRNA表达在肠癌组织显著高于癌旁组织(图3,表4)，远癌组织未见表达。

图1　heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白在各组的表达

2.3大肠癌组织中ErbB-2及MMP-7各自的mRNA表达与蛋白表达的相关性ErbB-2 mRNA表达及蛋白表达呈显著正相关关系(r=0.78，P<0.01)，前者表达较高的标本，后者表达也高。MMP-7在大肠癌组织中的mRNA表达及蛋白表达也呈显著正相关关系(r=0.83，P<0.01)。

2.4大肠癌组织中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表达的相关性大肠癌组织中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表达两两之间呈正相关(P均<0.05)(表5)。

2.5heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表达与大肠癌临床病理特征的关系在47例免疫印迹检测的大肠癌组织中，heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表达与肿瘤组织学分级、Dukes分期及有无淋巴结转移具有显著相关性(P均<0.05)，而与患者年龄、性别及肿瘤的组织学类型无明显相关(表6)。

表1　heregulin分别在肠癌组织组、癌旁组织组及远癌组织组的蛋白表达±s)

与远癌组织组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与癌旁组织组比较：3)P<0.05，下表同

表2　ErbB-2分别在肠癌组织组、癌旁组织组及远癌组织组的蛋白表达±s)

表3　MMP-7分别在肠癌组织组、癌旁组织组的蛋白表达±s)

与癌旁组织组比较：1)P<0.01

图3　ErbB-2、MMP-7 mRNA在各组的表达

组别nErbBmRNAMMP-7mRNA大肠癌组4753.09±11.131)83.29±10.202)癌旁组织组2038.21±6.2037.78±5.91远癌组织组1230.29±10.20-

与远癌组织组比较：1)P<0.05；与癌旁组织组比较：2)P<0.01；-:未表达

表5　大肠癌组织中heregulin、ErbB-2及

1)P<0.01，2)P<0.05

表6　heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表达条带强度与大肠癌临床病理特征的关系

与低分化组比较：1)P<0.05；与C+D期比较：2)P<0.05；与有淋巴结转移组比较：3)P<0.05

3讨论

大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率有升高趋势。癌基因ErbB-2，是表皮生长因子受体家族(EGFR家族)的中心成员，可在多种恶性肿瘤进展中起到关键作用，为近年来肿瘤诊治研究热点〔15，16〕。当前较多资料表明，ErbB-2参与大肠癌的发病机制，但具体观点不尽相同。Li等〔17〕用荧光免疫杂交法及免疫组化法检测结直肠癌中ErbB-2表达，结果发现无论在肿瘤早期基因扩增独立的转录激活作用中，还是在肿瘤进展后期基因扩增依赖的过表达中，ErbB-2对CRC肿瘤发生都起着至关重要的作用。 李文婷等〔18，19〕报道ErbB-2蛋白在大肠癌组织过表达，并且其表达与大肠癌临床分期、淋巴结转移有关，可作为判定大肠癌生物学行为和预后的重要参考指标。然而曾瑄等〔20〕观点差异较大，研究采用荧光原位杂交法(FISH)和免疫组化法检测了我国42例结直肠癌患者ErbB-2的蛋白表达和基因状态，其研究显示ErbB-2蛋白表达和基因拷贝数增加的效率均较低，推测不同的抗体和方法学以及标本的储存时间(影响染色强度)都可能是造成研究结果迥异的原因，因此提出有待于评分系统的统一和更大研究数据的积累。本实验结果提示，ErbB-2无论是基因水平还是蛋白水平的表达都与大肠癌的进展及恶性程度密切相关。这与Li等〔17,18〕的研究结果比较一致。

heregulin是Holmes等于1992年在生长人乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养基中分离得到，分子量为45 kD，它是表皮生长因子家族(EGF家族)的分支，具有表皮生长因子(EGF)样结构〔8〕。虽然资料报道heregulin在很多癌组织中表达，但有关大肠癌中heregulin表达及其作用的报道甚少。本研究提示heregulin与大肠癌的发生发展和恶性程度密切相关。

在对人乳腺癌的体内外大量研究中发现，heregulin在人乳腺癌上皮细胞中具有促有丝分裂作用，heregulin与受体ErbB-3/4结合后，ErbB-2同ErbB-3/4之间形成异二聚体，随之发生ErbB-2的磷酸化作用，自身磷酸化的ErbB-2紧接着磷酸化ErbB-3/4，进而磷酸化激活下游信号蛋白，通过复杂的信号网络诱导ErbB-2过表达细胞的增殖、黏附和运动〔21，22〕。而有关大肠癌中heregulin与ErbB-2的相关性鲜见报道。本研究推测大肠癌中，heregulin可能磷酸化激活ErbB-2/3/4后，再进一步增强其下游的信号转导，通过复杂的分子机制诱导肿瘤细胞增殖和侵袭。

大量研究表明，肿瘤细胞侵袭浸润的关键因素之一是肿瘤细胞周围细胞外基质(ECM)的降解〔23〕。ECM的降解又主要是依赖基质金属蛋白酶(MMPs)来完成。MMPs是一组Zn2+依赖性蛋白酶，目前已发现至少25种MMP。MMP-7是MMPs家族分子量最小的成员，属于基质分解素一类，具有强大的基质降解活性和广泛的底物特异性〔24，25〕。众多研究表明，MMP-7在结肠癌等肿瘤的侵袭浸润中起重要作用，是肿瘤恶性进展的标志，可作为判断恶性程度的指标〔26～30〕。

依据实验数据，推测在大肠癌组织中，很可能过表达的heregulin磷酸化激活过表达的ErbB-2，再激活一系列下游信号通路，应答效应之一是在核内促进MMP-7基因过表达，进而促使MMP-7蛋白过表达，MMP-7再发挥强大的降解肿瘤细胞周围ECM的作用，增强肿瘤细胞对周围组织的浸润侵袭，最终影响大肠癌的恶性进展及其预后。据此分析，heregulin及ErbB-2 可能成为大肠癌恶性程度及进展的新分子标记物。至于heregulin磷酸化ErbB-2后，其下游调节MMP-7表达的具体信号转导途径，以及可能存在的与之交织的其他信号网络等问题尚待进一步研究。

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〔2014-06-30修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：周青(1981-)，女，硕士，讲师，主要从事肿瘤病理学研究。第一作者：王冬芽(1981-)，男，副主任医师，主要从事肿瘤基础与临床研究。

中图分类号〔〕R735.34〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0046-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.021