盐酸法舒地尔对慢性心力衰竭大鼠心肌组织Toll样受体/MyD88信号通路的影响

陈　华　陈淑霞　袁　静　王立立　吕妍琨　杜荣品　谷　剑　李　燕

(河北省人民医院心脏中心，河北　石家庄　050051)



盐酸法舒地尔对慢性心力衰竭大鼠心肌组织Toll样受体/MyD88信号通路的影响

陈华陈淑霞袁静王立立吕妍琨杜荣品谷剑李燕1

(河北省人民医院心脏中心，河北石家庄050051)

摘要〔〕目的探讨盐酸法舒地尔对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌组织Toll样受体(TLR)/MyD88信号通路的调节作用。方法采用冠状动脉前降支结扎法建立CHF大鼠模型，分为健康对照组、模型组、治疗(盐酸法舒地尔)组和地高辛组，给予相应药物干预4 w后，观察大鼠心脏功能指标，采用实时聚合酶链反应(PCR)和Western印迹法分别检测各组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88 mRNA和蛋白表达水平。结果模型组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88 mRNA及蛋白表达水平较对照组明显增高(P<0.01)。同时，模型组心功能指标左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室重量指数(LVMI)与对照组相比明显增高(P<0.01)，而左心室内压最大上升、下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)则显著降低(P<0.01)。治疗组干预后，无论是在mRNA还是在蛋白表达水平，心肌组织TLR2、TLR4和MyD88表达水平均显著下调(P<0.01)，同时可明显改善心脏功能指标(P<0.01)。结论盐酸法舒地尔可能通过下调CHF大鼠心肌组织TLR2、TLR4和MyD88表达水平，抑制TLR/MyD88信号通路来改善CHF症状。

关键词〔〕慢性心力衰竭；盐酸法舒地尔；TLR/MyD88信号通路

1河北省人民医院血液科

第一作者：陈华(1980-),女,硕士，主治医师,主要从事心血管病研究。

慢性心力衰竭(CHF)是大部分心血管疾病终末阶段所表现出的一种常见的复杂临床症状群，以肺循环和体循环淤血为主要特征。其发病率、致残率和致死率均较高，病情复杂，总体预后差，并且需较高的医疗支出，严重威胁患者的健康〔1〕。CHF患者的神经激素系统活性、炎性细胞因子水平及氧化应激作用明显增强，同时剪切力降低导致机体内皮舒缩功能障碍〔2〕。血管内皮功能障碍反过来增加冠状动脉阻力，降低血流量和血管顺应性，外周血管过度扩张易增加心脏后负荷，导致心肌缺血加重，形成恶性循环从而加重心力衰竭，提示内皮功能是CHF防治的潜在靶点〔3〕。盐酸法舒地尔是一种新型的小分子G蛋白(Rho)激酶抑制物，研究证实了盐酸法舒地尔可防止缺血再灌注损伤，改善脑组织微循环，减少心肌细胞凋亡，扩张血管，同时可降低内皮细胞的张力、降低血液黏滞性和血栓形成及拮抗炎性因子〔4〕。本研究观察盐酸法舒地尔对CHF大鼠心肌组织Toll样受体(TLR)/MyD88信号通路的影响，并初步探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料6～8 w龄健康雄性SD大鼠60只，平均体质量(200±20)g，清洁级，购自北京实验动物研究中心，饲养1 w后开始实验。盐酸法舒地尔(2 ml：30 mg)购自山西普德药业股份有限公司，地高辛片(0.25 mg/片)购自赛诺菲(杭州)制药有限公司，抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗体购自Santa Cruz公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)购自碧云天生物技术研究所产品，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)均购自宝生物工程(大连)有限公司，电化学发光(ECL)发光试剂盒购自美国Pierce公司；其他化学试剂均为国产分析纯。ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDA-PAGE)电泳槽、电泳仪和转膜仪(Bio-Rad公司)，化学发光成像系统(以色列DNR成像系统有限公司)。

1.2引物设计根据NCBI Genbank上已公布的大鼠TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH基因的mRNA序列及相关参考文献合成TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH的定量PCR引物〔5〕，序列见表1，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　RT-PCR引物序列

1.3模型建立及动物分组采用冠状动脉前降支结扎法建立CHF大鼠模型。1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射大鼠，麻醉后于胸骨左侧4～5肋间找到心尖搏动最明显处作横向切口，剪开皮肤钝性分离肌层后找到心脏，用眼科镊和直剪剪开心包膜，然后将心脏底面翻转，在离左冠状动脉前降支2 mm处用6/0号手术缝合线将冠状动脉前降支结扎，利用生理记录仪观察心电图，心肌梗死模型建立的标准为心电图显示ST段弓背向上抬高，术后青霉素预防伤口感染。4 w后行心脏超声检查及血流动力学监测，以射血分数(EF)值降至60%以下大鼠为标准入选心力衰竭组。60只大鼠随机挑出10只作为对照组，剩余50只大鼠用于造模，将造模成功的大鼠按数字随机分为3组：模型组、治疗组(盐酸法舒地尔5 mg/kg)和地高辛组(0.25 mg/kg)，对照组和模型组每日经胃管喂养相同剂量生理盐水作为安慰剂，每日两次用药，连续饲养4 w，记录造模大鼠死亡情况，所有大鼠均统一饲养，观察所有大鼠情况，在整个实验期间自由饮水进食。

1.4心功能指标测定药物干预4 w后3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，在大鼠颈前正中作切口，于右颈总动脉逆行插管至左心室，然后将多媒体生物信号记录仪系统连接至另一端以检测大鼠心功能。检测指标为包括左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)及左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。同时，取出左心室称重，计算左心室重量指数(LVMI)，即LVMI=大鼠左心室重量/大鼠体重。

1.5RNA提取与实时定量PCR将心肌组织50 mg剪碎置于组织研磨钵中，加入2 ml Trizol和适量液氮后反复充分研磨，室温静置5 min。将液体转移至1.5 ml无RNA酶的EP管中，加入0.2 ml氯仿后剧烈振荡15 s，室温静置5 min。14 000 r/min 4℃离心10 min，离心后分上中下三层，上层水相为RNA。小心吸出上层水相转移至1.5 ml无RNA酶的新EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次充分混匀，室温静置10 min。14 000 r/min 4℃离心10 min，小心弃去上清液，加入1 ml 焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制的75%乙醇轻微洗涤沉淀，不宜振荡，14 000 r/min 4℃离心10 min。小心弃去上清液，将EP管放于超净台，风干沉淀，用20 μl无RNA酶的ddH2O溶解即得到总RNA。利用DNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提及异丙醇沉淀纯化RNA。按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录试剂盒获得mRNA，根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒操作说明书配制荧光定量PCR反应体系，于荧光定量PCR仪进行样本的PCR扩增，各基因mRNA表达水平通过2-ΔCt表示。

1.6蛋白提取与Western印迹测定用含有0.1% PMSF的预冷生理盐水冲洗心肌组织，取100 mg组织加入400 μl RIPA裂解液后于组织研磨器上研磨，然后冰上静置30 min，10 000 r/min 4℃离心30 min，去上清液，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。配置12%下层分离胶和5%上层浓缩胶，取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE上样缓冲液沸水中孵育10 min，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后切下目的蛋白凝胶于转膜仪上转膜，转膜后的膜用含有5%脱脂奶粉的吐温-20的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)封闭液封闭，一抗兔抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗体孵育过夜，TBST液洗膜后加入二抗结合1 h，冲洗后利用ECL发光试剂盒显影，于化学发光成像系统观察、拍照。

1.7统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1一般情况采用冠状动脉前降支结扎法共造模50只，未出现麻醉过量而引起大鼠死亡，但术中有13只出现失血过多、心脏穿孔和心肌梗死等引起的死亡，术中死亡率为26%。术后4 w内有5只大鼠由于心肌梗死过重失代偿陆续死亡，且全部发生在术后2 w内，术后死亡率为13.52%。术后4 w后尚成活32只，手术成活率为64%，按数字随机分成3组：模型组(n=11)、治疗组(n=11)和地高辛组(n=10)，在随后的实验干预中并未见有大鼠出现死亡。CHF造模后大鼠出现不同程度的食欲减退、精神较差及张口呼吸、乏力等心力衰竭症状，并且术后体重与对照组相比明显下降(P<0.01)，术后4 w内虽有所回升，但差异无统计学意义。治疗组和地高辛组干预后体重逐渐恢复，明显高于模型组(P<0.01)，但治疗组和地高辛组差异无统计学意义。

2.2各组心功能比较与对照组相比，其他3组LVSP、LVEDP和LVMI明显增高(P<0.01)，而+dp/dtmax和-dp/dtmax则显著降低(P<0.01)。治疗组和地高辛组治疗后各项心功能与模型组均有明显改善(P<0.01)，但治疗组和地高辛组差异无统计学意义。见表2。

2.3各组心肌TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达的影响与对照组相比，其他3组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达明显增高(P<0.01)。药物干预后，治疗组和地高辛组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达量均显著下调(P<0.01)，但表达量仍明显高于对照组(P<0.01)，同时治疗组和地高辛组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达量差异不显著。见表2。

2.4各组心肌TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达的影响对照组中TLR2、TLR4和MyD88蛋白均有所表达，TLR4表达量最弱，模型组心肌组织TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达水平与对照组相比明显上调，而治疗组治疗后蛋白表达水平有所降低，这与地高辛组一样。见图1。

表2　各组大鼠心功能情况及TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达比较

与对照组相比:1)P<0.01；与模型组相比:2)P<0.01

图1　各组TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达比较

3讨论

有学者提出通过膳食调理改善营养水平有助于预防CHF的发生，并且一度被认为是最有吸引力的策略之一。但CHF是一种神经-体液和炎症性综合征，CHF的发生和发展涉及多种分子和细胞复杂机制的参与。简单地改善饮食结构并不能达到理想结果。传统药物治疗如血管紧张素转换酶抑制剂、利尿剂、β-受体阻滞剂等虽然可减轻CHF症状，增加运动耐力，可适当提高患者生存率，但患者预后和生活质量往往较差，仍需进一步改善〔6〕。血管内皮舒缩功能障碍和心脏收缩的生理调节异常在CHF发生和发展过程中起着重要作用〔7〕。RhoA位于Gq下游，是一种低分子量的GTP酶，该蛋白具有参与心肌重塑的功能〔8〕。因此，改善心肌收缩功能是CHF防治的潜在靶标。

目前已研究的Rho激酶抑制剂药物较多，且更新换代较快，盐酸法舒地尔作为新型神经保护剂已在临床应用中取得显著效果。盐酸法舒地尔是5-异喹啉磺酰胺衍生物，具有广泛的药理学作用，早期主要应用于治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛，而随后研究证实了它能有效扩张血管、保护缺血脑组织〔9〕。盐酸法舒地尔通过进入肌细胞与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点而阻断Rho激酶的活性，通过调控肌球蛋白结合亚基磷酸化水平途径参与心肌细胞收缩调节。同时，盐酸法舒地尔还具有降低心室肥厚指数和心室壁张力及提高心室肌弹性和顺应性、改善血流动力学的功能。刘克强〔10〕指出，冠心病心力衰竭患者在给予利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂和硝酸酯治疗的基础上静脉滴注含有法舒地尔注射液的葡萄糖，每月1个疗程，连用3个月，治疗后未发现患者有明显不良反应，且治疗前后各项生化指标无明显变化，同时可明显提高左心室EF及降低左心室收缩末容量和舒张末容量。临床效果分析显示，盐酸法舒地尔可显著改善冠心病心力衰竭临床症状，总有效率达到89.3%。

近来的动物实验研究显示，TLR2基因缺陷小鼠经冠状动脉结扎造模后死亡率和左心室功能不良发生率明显低于正常的小鼠〔11〕，而TLR4基因缺陷的小鼠对烧伤后引起的心力衰竭发生率明显降低〔12〕。同时临床研究也发现老年CHF患者外周血单核细胞表面的TLR2/4表达水平显著上调〔13〕。这些研究表明TLR2/4的表达显著上调可能是促进CHF的发生和发展的重要机制之一。

综上，可以推断抑制TLR/MyD88信号通路可能是盐酸法舒地尔防治CHF的作用机制之一。

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〔2015-01-19修回〕

(编辑苑云杰)

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中图分类号〔〕R541〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0055-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.024