14-3-3γ对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌损伤的保护作用

王莉萍　王俊萍

(西安交通大学附属红会医院心内科，陕西　西安　710054)



14-3-3γ对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌损伤的保护作用

王莉萍王俊萍1

(西安交通大学附属红会医院心内科，陕西西安710054)

摘要〔〕目的研究14-3-3γ在异丙肾上腺素(Iso) 诱导的大鼠心肌损伤中的保护作用。方法构建pcDNA3.1-14-3-3γ重组载体，使用pcDNA3.1-14-3-3γ或pcDNA3.1对体外培养的H9c2(2-1)细胞进行转染。实验分为四组：pcDNA3.1-14-3-3γ+Iso损伤组，pcDNA3.1+Iso损伤组，Iso损伤组及空白对照组(未经任何处理细胞组)。Western印迹检测心肌细胞中14-3-3γ的表达情况；MTT法检测心肌细胞增长率；取培养液检测各组细胞丙二醛(MDA)含量变化和超氧化物歧化酶(SOD)活性变化；流式细胞法检测重组质粒转染对心肌细胞凋亡的影响。结果Iso损伤使心肌细胞的MDA含量显著增加、SOD活性降低、细胞增长率降低、细胞凋亡增加，转染pcDNA3.1-14-3-3γ重组质粒后再进行Iso损伤，则MDA含量显著减少、SOD活性增高、细胞增长率增高、细胞凋亡减少(P<0.05)。结论14-3-3γ对Iso诱导的大鼠心肌细胞损伤有明显的对抗和保护作用。

关键词〔〕14-3-3γ；心肌损伤；异丙肾上腺素

1陕西省友谊医院心内科

第一作者：王莉萍(1969-)，女，副主任医师，硕士，主要从事心血管疾病研究。

在我国，心脑血管疾病已成为仅次于恶性肿瘤的第二杀手。心肌细胞凋亡普遍参与心血管系统的发生与发展，是多种心血管疾病的重要病理生理机制之一〔1〕。异丙肾上腺素(Iso) 是一种β受体激动剂〔2〕。Iso在心衰患者体内出现异常高表达，进一步在动物模式实验中研究发现，乳鼠的心肌细胞通过Iso诱导能引起细胞损伤〔3〕。Iso是一种人工合成的儿茶酚胺类物质，常用于建立缺血性心脏病及心力衰竭的动物模型〔4～6〕。14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性二聚体可溶性蛋白家族〔7〕，此类蛋白是一类广泛存在的调控因子，可通过与其他蛋白的相互作用参与细胞周期、信号转导、细胞增殖、迁移、细胞凋亡等众多生理过程的调节〔8～11〕。14-3-3蛋白家族在不同的生物中种类也不同，有2～13种不等〔12〕。在哺乳动物中14-3-3有7种亚型〔13,14〕，14-3-3γ是其中一种亚型，其作为细胞内磷酸化作用的重要因子，参与多种病理生理过程。研究表明，14-3-3γ蛋白在主动脉受损的大鼠心肌组织中表达明显上调〔15〕，提示其有可能在心肌组织的损伤修护及对损伤的反应方面发挥重要作用。本研究通过构建Iso诱导心肌损伤模型，研究14-3-3γ对心肌细胞Iso损伤的保护作用及其作用机制。

1材料与方法

1.1细胞系及载体大鼠心肌细胞H9c2(2-1)购于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)；载体pcDNA3.1购于Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。Iso购于Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购于Gibco公司。AV/PI双染凋亡检测试剂盒购于BD公司(San Diego,USA)；山羊抗鼠14-3-3γ和β-actin一抗，HRP-标记的兔抗山羊二抗购于美国Pierce公司。

1.2构建含有14-3-3γ的表达质粒提取H9c2(2-1)细胞总RNA进行反转录。以反转录产物cDNA为模板，PCR扩增。PCR反应条件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s,30个循环；最后72℃延伸5 min。引物信息如下：上游引物5′-AAG AAT TCC CCC GCG AAG ATG-3′，下游引物5′-TTA GGT ACC TGG GGC CTT AGT TGT T-3′。引物设计中在上、下游分别引入EcoR Ⅰ与Kpn Ⅰ的酶切位点及保护性碱基。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切PCR扩增得到的目的基因及质粒载体pcDNA3.1，分别收集目的片段后使用T4连接酶进行连接，构建重组pcDNA3.1-14-3-3γ质粒，并进行酶切鉴定和测序鉴定。

1.3细胞培养及分组处理大鼠心肌细胞H9c2(2-1)培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃,5% CO2培养箱中培养。细胞分为4组：(1)正常对照组：未转染质粒，未经Iso处理；(2)Iso诱导心肌损伤组：在培养基中加入终浓度为10 μmol/L的Iso，孵育6 h；(3)Iso诱导心肌损伤+pcDNA3.1组：空载质粒pcDNA3.1转染H9c2(2-1)细胞24 h后处理同Iso诱导心急损伤组；(4)Iso诱导心肌损伤+pcDNA3.1-14-3-3γ组：重组质粒pcDNA3.1-14-3-3γ转染至H9c2(2-1)细胞中，24 h后处理同Iso诱导心急损伤组。

1.4Western印迹检测蛋白表达质粒转染组在Iso诱导处理前进行Western印迹，检测H9c2(2-1)细胞中14-3-3γ蛋白的表达。用放射免疫沉淀法(RIPA)细胞蛋白裂解液裂解各组H9c2(2-1)细胞，提取聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。以β-actin为内参，同等量蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后，进行电转膜，先后结合山羊抗鼠14-3-3γ/β-actin一抗和HRP-标记的兔抗山羊二抗，最后X 线胶片曝光分析，检测目的蛋白的表达水平。

1.5MTT比色法检测细胞存活率胰酶消化分组处理的H9c2(2-1)细胞制备单细胞悬液，每组细胞以6×104个/孔接种于96孔培养板，细胞融合达到80%左右时开始检测。原培养基吸弃后，每孔加入20 μl MTT〔5 mg/ml溶于磷酸盐缓冲液(PBS)〕，37℃恒温箱中培养4 h。吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，震荡10 min充分溶解蓝色结晶。用酶标仪(Bio-tek Instruments/USA)在490 nm波长处测量其吸光值。

1.6丙二醛(MDA)含量测定酶联法测定细胞MDA含量。按照MDA试剂盒使用说明测定H9c2(2-1)细胞的MDA含量。即收集细胞加入20% TCA孵育20 min。加入0.1 mol/L HCl和0.67%硫代巴比妥酸(TBA)于95℃水浴1 h，离心后在532 nm波长处测量其吸光值。

1.7超氧化物歧化酶(SOD)含量测定按照SOD试剂盒使用说明完成。每组细胞样品加入水溶性四唑盐(WST)工作液与酶工作液，于37℃恒温箱中孵育20 min，在540 nm波长处测量其吸光值。

1.8流式细胞法检测细胞凋亡用4℃预冷的PBS洗涤各组H9c2(2-1)细胞，加入0.25%胰酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化并收集细胞，加入1×Annexin Ⅴ结合缓冲液1 ml,离心后弃上清，加入结合缓冲液200 μl重悬细胞。在细胞悬液中加入Annexin V-FITC 10 μl PI(5 mg/L)5 μl，混合后37℃避光孵育30 min。以488 nm为激发波长，以530 nm为发射波长，用流式细胞仪检测。

1.9数据分析采用统计学软件SPSS13.0进行t检验。

2结果

2.1pcDNA3.1-14-3-3γ转染心肌细胞后14-3-3γ蛋白表达显著上调H9c2(2-1)细胞转染pcDNA3.1-14-3-3γ后，14-3-3γ蛋白表达(1.52 fold)较其他3组显著上调(P<0.01)，正常对照组(0.62 fold)、Iso组(0.73 fold)、IsotpcDNA3.1组(0.75 fold)，表明重组质粒成功转染至H9c2(2-1)细胞(见图1)。

图1　转染pcDNA3.1-14-3-3γ对Iso损伤心肌细胞后14-3-3γ蛋白表达的影响

2.2pcDNA3.1-14-3-3γ转染诱发Iso损伤心肌细胞存活率显著升高经Iso处理的H9c2(2-1)细胞与正常对照组相比，细胞存活率(210% vs 100%)明显下降(P<0.05)；转染pcDNA3.1-14-3-3γ后经Iso处理(86%)与单纯Iso处理组(21%)及正常对照组相比，细胞存活率明显升高(P<0.05)。

2.3pcDNA3.1-14-3-3γ转染Iso损伤心肌细胞后MDA含量显著降低，SOD活性显著升高H9c2(2-1)细胞经Iso处理后MDA的含量显著增加(P<0.05)，SOD活性显著降低；pcDNA3.1-14-3-3γ质粒转染至细胞后经Iso处理与单纯Iso处理组以及空载质粒转染组相比，MDA含量显著降低，SOD活性显著升高(P<0.05)。见表1。

表1　转染pcDNA3.1-14-3-3γ对Iso损伤心肌细胞后

与正常对照组比较：1)P<0.05;与Iso组比较：2)P<0.05

2.4转染pcDNA3.1-14-3-3γ至Iso损伤心肌细胞后，细胞凋亡减少Iso处理使H9c2(2-1)细胞的凋亡明显增加，pcDNA3.1-14-3-3γ质粒转染至细胞后经Iso处理较之Iso处理组以及空载质粒转染组，细胞凋亡减少(见图2)。

图2　转染pcDNA3.1-14-3-3γ对Iso损伤心肌细胞后细胞凋亡的影响

3讨论

心肌细胞的损伤是参与各种心血管疾病病理和生理的重要机制之一。Iso对心肌细胞具有强烈变时、变力效应，对冠状动脉微循环具有显著的抑制效应，且对心肌细胞具有直接的毒性效应，可造成严重心肌损伤，甚至导致动物死亡。14-3-3蛋白是1967年发现的一类高度保守的小分子二聚体〔16〕，有7个亚型，14-3-3γ是该家族中的一员。14-3-3γ几乎存在于所有生物体细胞中，通过细胞内磷酸化作用参与许多生理病理的调节过程〔17〕。已有研究结果显示在心肌细胞损伤的乳鼠细胞中，14-3-3γ出现高表达的现象〔18〕。

本研究说明重组质粒能在心肌细胞中有效表达。14-3-3γ可减少由Iso引起的MDA含量的增加，对Iso的细胞毒性有逆转作用，对Iso细胞损伤有保护作用。SOD在细胞中有清除氧自由基，减少脂质过氧化物产生的作用，研究结果发现14-3-3γ可增强SOD的活性，这一结果与MDA含量的减少相符合，因此，推断14-3-3γ是通过降低细胞内过量的自由基减轻心肌细胞受损伤的程度。14-3-3γ能使细胞逃避凋亡，明显提高心肌细胞对抗Iso损伤的能力。

综上，Iso会引起心肌细胞的损伤，但转染重组质粒pcDNA3.1-14-3-3γ，可以通过清除细胞内过量的自由基减轻心肌细胞受损伤的程度，说明14-3-3γ对Iso诱导的心肌细胞损伤有明显的对抗和保护作用。

参考文献4

1曾贵云，徐向伟，刘厚孝.心衰的实验模型〔J〕.药学学报,2002;37(7):579-85.

2郑铭，韩启德，肖瑞平.心脏中不同β肾上腺素受体亚型的信号体系及其病理生理意义〔J〕.生理学报,2004;56(1):1-15.

3Communal C,Singh K,Pimentel DR,etal.Norepinephrine stimulates apoptosis in adult rat ventricular myocytes by activation of the beta-adrenergic pathway〔J〕.Circulation,1998;98(13):1329-34.

4Hussain Shaik A,Rasool SN,Abdul Kareem M,etal.Maslinic acid protects against isoproterenol-induced cardiotoxicity in albino Wistar rats〔J〕.J Med Food,2012;15(8):741-6.

5Nagoor Meeran MF,Stanely Mainzen Prince P.Protective effects of N-acetyl cysteine on membrane-bound adenosine triphosphatases and minerals in isoproterenol-induced myocardial-infarcted rats:an in vivo and in vitro study〔J〕.J Biochem Mol Toxicol,2012;26(7):276-81.

6Patel DK,Desai SN,Gandhi HP,etal.Cardio protective effect of Coriandrum sativum L.on isoproterenol induced myocardial necrosis in rats〔J〕.Food Chem Toxicol,2012;50(9):3120-5.

7Mhawech P.14-3-3 proteins--an update〔J〕.Cell Res,2005;15(4):228-36.

8van Hemert MJ,Steensma HY,van Heusden GP.14-3-3 proteins:key regulators of cell division,signalling and apoptosis〔J〕.Bioessays,2001；23(10):936-46.

9Obsilova V,Silhan J,Boura E,etal.14-3-3 proteins:a family of versatile molecular regulators〔J〕.Physiol Res,2008;57(Suppl 3):S11-21.

10Morrison DK.The 14-3-3 proteins:integrators of diverse signaling cues that impact cell fate and cancer development〔J〕.Trends Cell Biol,2009;19(1):16-23.

11Bustos DM.The role of protein disorder in the 14-3-3 interaction network〔J〕.Mol Biosyst,2012;8(1):178-84.

12Gardino AK,Smerdon SJ,Yaffe MB.Structural determinants of 14-3-3 binding specificities and regulation of subcellular localization of 14-3-3-ligand complexes:a comparison of the X-ray crystal structures of all human 14-3-3 isoforms〔J〕.Semin Cancer Biol,2006;16(3):173-82.

13Chaudhri M,Scarabel M,Aitken A.Mammalian and yeast 14-3-3 isoforms form distinct patterns of dimers in vivo〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2003;300(3):679-85.

14Aitken A.14-3-3 proteins:a historic overview〔J〕.Semin Cancer Biol,2006;16(3):162-72.

15Autieri MV.Inducible expression of the signal transduction protein 14-3-3 gamma in injured arteries and stimulated human vascular smooth muscle cells〔J〕.Exp Mol Pathol,2004;76(2):99-107.

16Shimada T,Fournier AE,Yamagata K.Neuroprotective function of 14-3-3 proteins in neurodegeneration〔J〕.Biomed Res Int,2013;2013:564534.

17Zhao J,Meyerkord CL,Du Y,etal.14-3-3 proteins as potential therapeutic targets〔J〕.Semin Cell Dev Biol,2011;22(7):705-12.

18He M,Zhang J,Shao L,etal.Upregulation of 14-3-3 isoforms in acute rat myocardial injuries induced by burn and lipopolysaccharide〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2006;33(4):374-80.

〔2014-11-19修回〕

(编辑杜娟)

中图分类号〔〕R542.2〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0042-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.019