山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠脑组织c-fos、Bcl-2蛋白表达的影响

吴晓光　檀荣方　杨　岚　李蒙蒙　张天鸽　张　强

(河北省中医药抗痴呆重点研究室，河北　承德　067000)



山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠脑组织c-fos、Bcl-2蛋白表达的影响

吴晓光檀荣方杨岚李蒙蒙张天鸽张强

(河北省中医药抗痴呆重点研究室，河北承德067000)

摘要〔〕目的探讨山楂叶总黄酮(TFHL)对慢性脑缺血大鼠的治疗作用及机制。方法健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、TFHL组、银杏叶片组。采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备脑缺血模型。免疫组化法检测c-fos蛋白的表达，Western印迹法检测Bcl-2蛋白的表达，原子分光光度法检测脑组织Ca2+含量。结果与模型组比较，TFHL显著抑制大鼠缺血脑组织c-fos蛋白表达(P<0.01)，增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05)，降低Ca2+含量(P<0.05)。结论TFHL对慢性脑缺血的保护作用与抑制脑神经细胞凋亡有关，其抗凋亡的机制可能与上调Bcl-2表达，下调c-fos表达，降低脑组织Ca2+含量有关。

关键词〔〕山楂叶总黄酮；慢性脑缺血；c-fos；Bcl-2；Ca2+

第一作者：吴晓光(1975-)，男，硕士，副研究员，硕士生导师，主要从事中医药抗痴呆机制研究。

细胞凋亡与缺血性脑损伤的关系极为密切。脑缺血后，c-fos的过度表达能阻断细胞内信号的转导而产生一些促调亡因子〔1〕，参与脑缺血损伤后的神经细胞凋亡过程。Bcl-2是抑制细胞凋亡因子，与细胞凋亡密切相关，抑制或减少损伤后神经细胞凋亡成为缺血性脑血管病治疗的关键〔2〕。山楂叶总黄酮(TFHL)是从山楂叶中提取的黄酮类化合物，具有降血脂、抗氧化等〔3〕功能，但其对c-fos和Bcl-2基因表达的影响尚不清楚。本研究采用双侧颈总动脉结扎法制备慢性脑缺血模型，观察TFHL对脑缺血大鼠c-fos、Bcl-2表达的影响，并探讨其可能机制，为防治缺血性脑血管病提供实验依据。

1材料与方法

1.1药物与试剂摘采承德本地7～8月份的山楂树叶，采用水煎醇沉法〔4〕提取TFHL，纯度为65.2%。c-fos、Bcl-2多克隆抗体(武汉博士德生物科技有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中山金桥生物科技有限公司)。

1.2动物模型制备及分组清洁级SD大鼠72只，雄性，体质量250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔格证号：scxk(京)2012-0001〕。随机分等为四组：假手术组、模型组、TFHL组、银杏叶片组。采用双侧颈总动脉结扎法建立大鼠脑缺血模型〔5〕，假手术组仅分离双侧颈总动脉，不结扎。术后第7天开始，TFHL组及银杏叶片组大鼠分别灌胃给予TFHL 140 mg·kg-1·d-1和银杏叶片12.3 mg·kg-1·d-1，共21 d。假手术组及模型组给予等量的生理盐水。

1.3观察指标及方法

1.3.1免疫组化检测c-fos蛋白的表达末次给药后1 h，4%水合氯醛麻醉，10% 甲醛心脏灌注固定，取视交叉后2～8 mm之间的脑组织，常规石蜡包埋，5 μm厚冠状面切片。切片经过二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.3%H2O2孵育30 min，山羊血清封闭30 min，滴加c-fos一抗(1∶100)40 μl，4℃冰箱过夜，生物素标记羊抗兔IgG 50 μl孵育30 min，DAB显色5 min，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察，拍片。MINT图像分析系统分析阳性表达产物的光密度值。

1.3.2Western印迹法检测Bcl-2蛋白的表达末次给药后1 h，0.01 mol/L PBS洗净血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃匀浆，10 000 r/min，离心30 min ，取上清液，BAC蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。再经过SDS-PAGE电泳、转膜、10%脱脂奶粉封闭，加Bcl-2一抗(1∶150)4℃过夜，HRP标记的二抗(1∶1 000)室温孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏发光液发光，X线片暗盒内曝光，D72显影液显影，利用Quantity One软件分析X线胶片的灰度值。

1.3.3原子分光光度法检测Ca2+含量末次给药后1 h，大鼠断头，取脑组织，剥离软脑膜，超纯水漂洗，去除残余血液，60℃温箱烘烤48 h，分析天平称重，滴加浓硝酸，逐渐全部消化成溶液，取样，1%CaCl2稀释，利用原子分光光度法检测样品Ca2+含量。

1.4统计学方法采用SPSS16.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1各组大鼠脑组织c-fos蛋白的表达与假手术组比较，模型组c-fos蛋白升高(324.78.94±50.37)%〔(0.046 3±0.005 83)，P<0.01〕；与模型组比较，银杏叶片组(0.016 8±0.000 54)和TFHL组(0.017 6±0.000 61)的c-fos蛋白分别降低了(63.71±11.42)%和(61.98±11.27)%，具有显著差异(P<0.01)；银杏叶片组与TFHL组之间比较无差异(P>0.05)。见表1，图1。

图1　各组大鼠脑组织c-fos蛋白的表达(DAB，×400)

2.2各组大鼠脑组织Bcl-2蛋白的表达假手术组(0.28±0.02)有少量的Bcl-2蛋白表达。与假手术组比较，模型组Bcl-2蛋白的表达升高(17.89±3.19)% (0.33±0.06，P<0.05)；与模型组比较，银杏叶片组(0.70±0.08)和TFHL组(0.68±0.09)的Bcl-2蛋白的表达明显增高(112.12±6.14)%和(106.01±5.81)%，具有显著差异(P<0.01)；银杏叶片组与TFHL组之间比较无差异(P>0.05)。见图2。

图2　各组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达

2.3各组大鼠脑组织Ca2+的含量模型组大鼠脑组织Ca2+含量较假手术组显著增加(117.20±5.18)%〔(231.51±11.47)vs(106.59±6.87)μg/g，P<0.01〕；与模型组比较，银杏叶片组〔(142.32±5.17)μg/g〕和TFHL组〔(145.91±5.78)μg/g〕脑组织Ca2+含量分别降低了(38.53±2.13)%和(36.97±2.01)%，具有显著性差异(P<0.05)；银杏叶片组与TFHL组之间比较无差异(P>0.05)。

3讨论

脑血管疾病是由各种病因引起脑血管损伤所导致的一组临床疾病，其中缺血性脑血管疾病是最常见类型，其发病率、病

残率和病死率高，并常常伴有学习及认知功能障碍，严重影响患者的生活质量。脑血管疾病常常引起大脑神经功能缺失，而神经细胞凋亡是造成脑神经功能缺失的重要因素，抑制或减少损伤后神经细胞凋亡则是为缺血性脑血管病治疗的关键〔2〕。c-fos基因是mys家族的一员，编码核内DNA结合蛋白，调节基因转录。正常生理情况下，c-fos基因存在于中枢神经系统，处于低表达或静止状态，不易检测〔1〕。但在脑缺血损伤后，c-fos基因作为即刻早期反应基因迅速作出反应进行表达，其表达产物fos蛋白在生长因子刺激下，促进细胞分裂增殖，但c-fos过度表达时则会诱发细胞凋亡〔6，7〕；缺血还可促使Ca2+大量内流，神经细胞内Ca2+超载，引发神经细胞的损伤或死亡，导致脑神经功能障碍。本研究结果显示，脑缺血可以诱导神经细胞凋亡，表明TFHL可通过抑制c-fos蛋白过度表达，降低Ca2+超载，减轻神经细胞损伤。

Bcl-2是公认的具有抑制细胞凋亡作用的蛋白，可以抑制Bax从细胞质转位到线粒体膜，保护线粒体电势梯度，调节细胞内Ca2+的自稳状态和氧化还原状态从而抑制内在凋亡途径〔8〕。因此，Bcl-2蛋白表达量直接决定神经细胞的存活与凋亡取向。本研究结果显示，脑组织缺血缺氧，Bcl-2蛋白表达受到抑制，而c-fos过度表达，Ca2+超载，从而加快了神经细胞凋亡。应用山楂叶总黄酮可明显增加缺血脑组织Bcl-2蛋白的表达，从而抑制或逆转神经细胞凋亡。因此，TFHL的作用机制可能与其抑制Ca2+超载，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，减少促凋亡蛋白c-fos表达有关，但其减轻脑缺血诱导神经细胞凋亡的具体机制，还需要进一步研究。

参考文献4

1赵雪花,曾垦.葛根素对大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3和c-fos表达的影响〔J〕.数理医药学杂志,2012;25(5):511-2.

2赵雅宁,李建民,张姗姗,等.参芪化瘀胶囊通过PI3-K/Akt信号通路改善大鼠缺血性脑损伤〔J〕.西安交通大学学报医学版,2011；32(5):636-9.

3李红,张爽,纪影实,等.山楂叶总黄酮不同给药途径对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(3):995-7.

4王基平,孙华,李湘晖,等.脉炎消口服液的含量测定及药理作用〔J〕.中国医院药学杂志,2009;29(2):162-4.

5陈涛,周少华,刘南暖,等.促红细胞生成素对慢性脑缺血大鼠认知障碍及海马星形胶质细胞的影响〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(4):1588-90.

6罗国标,刘晓丽,张中菊,等.青藤碱对偏头痛模型大鼠脑干c-fos、c-jun表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志,2013;30(6):513-5.

7颜玲,黄德斌.黄芪多糖对缺血脑损伤大鼠海马神经递质及 c-fos mRNA表达的影响〔J〕.中国病理生理学杂志,2012;28(2):263-8.

8郭佳,肖传实,白瑞,等.脂联素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响〔J〕.中国药理学通报,2012;28(7):930-3.

〔2014-08-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：河北省科技厅指令课题(152777890)；河北省教育厅青年基金指令课题(QN201403)；河北省高校省级重点学科资助项目(2013年)；河北省中医药抗痴呆重点研究室建设项目资助(2013年)

中图分类号〔〕R749〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0033-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.014