趋化因子受体9、血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶2、9在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

王志维 牛玉旭 林 辉

(1 武汉大学人民医院胸心外科，武汉市 430060，E-mail：wangzhiwp@sina.com；2 广西壮族自治区人民医院胸心外科，南宁市 530021)

论著·临床研究

趋化因子受体9、血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶2、9在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

王志维1牛玉旭1林 辉2

(1 武汉大学人民医院胸心外科，武汉市 430060，E-mail：wangzhiwp@sina.com；2 广西壮族自治区人民医院胸心外科，南宁市 530021)

目的 探讨趋化因子受体9(CCR9)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)2及MMP9在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达情况及其临床意义。方法 采用免疫组化PV-9000法检测60例NSCLC患者肿瘤组织和癌旁组织中CCR9与VEGF、MMP2、MMP9的表达情况，分析肿瘤组织CCR9表达与临床病理特征及其他蛋白表达间的关系，以及肿瘤组织VEGF、MMP2、MMP9的阳性表达率与淋巴结转移间的关系。结果 肿瘤组织CCR9、VEGF、MMP2、MMP9蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)。腺癌、淋巴结转移患者的肿瘤组织CCR9阳性表达率分别高于鳞癌、无淋巴结转移患者(P<0.05)，淋巴结转移患者肿瘤组织MMP2及MMP9的阳性表达率均高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。VEGF阳性表达、MMP2阳性表达、MMP9阳性表达患者的肿瘤组织CCR9阳性表达率分别高于VEGF阴性表达、MMP2阴性表达、MMP9阴性表达患者(P<0.05)，且在淋巴结转移患者中，肿瘤组织CCR9的表达与VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表达均呈正相关(P<0.05)。结论 CCR9与VEGF、MMP2、MMP9蛋白的高表达可能在非小细胞肺癌的发生发展、侵袭转移中发挥重要作用，CCR9或许能通过某些信号通路来调控VEGF、MMP2、MMP9蛋白的表达，其可能会成为评估NSCLC病情发展的重要指标。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；趋化因子受体9；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶

Expression of chemokine receptor 9,vascular endothelial growth factor,matrix

肺癌属于全球常见的恶性肿瘤[1]，在我国肺癌的发病率和病死率一直居高不下[2]，其中约85%患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。目前临床上对NSCLC患者主要采取手术为主，放疗、化疗、生物、中医中药等为辅的综合治疗，但患者的治疗和预后未见突破性进展，患者的 5年总生存率不足20%[3]。对NSCLC的发病相关因素进行研究，并做到早发现、早诊断、早治疗，成为目前迫切需求。

越来越多的研究表明，趋化因子受体(chemokine receptor，CCR)9在卵巢癌[4-5]、胰腺癌[6]、乳腺癌[7]等多种恶性肿瘤中表达，其可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)已被证实具有强大的促进血管生长作用[8]，其与相应的受体结合以后能促进血管的新生及生长。同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一种细胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促进恶性肿瘤的侵袭和迁移[9]，其中MMP2和MMP9又是降解Ⅳ型胶原最主要的酶。本研究将对CCR9、VEGF、MMP2、MMP9在NSCLC中的表达情况及其之间的关系进行初步探索，为针对NSCLC发病机制及靶向治疗的后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年9月至2015年12月在广西壮族自治区人民医院胸心外科行手术治疗的NSCLC患者60例，收集其手术切除的肿瘤组织及癌旁组织石蜡包埋标本，所有病例术前均未接受放化疗及免疫治疗，且在术后及进入本研究前进行了双重病理学诊断。60例NSCLC患者中，肺腺癌35例，肺鳞癌25例；男性40例，女性20例；年龄31～76岁，平均年龄58岁；淋巴结转移阳性者45例，淋巴结转移阴性者15例。

1.2 主要试剂 兔抗人CCR9单克隆抗体购自英国Abcam公司(生产批号：GR105409)；即用型鼠抗人VEGF单克隆抗体购自福建迈新生物技术开发有限公司(生产批号：160202243C)；即用型兔抗人MMP2多克隆抗体(生产批号：15913112)、即用型兔抗人MMP9单克隆抗体、PV-9000试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)试剂盒均购自北京中杉金桥公司(生产批号：16690201、K152411C、15155A10)。

1.3 CCR9、VEGF、MMP2、MMP9的检测 采用免疫组织化学法(PV-9000法)对所得标本进行检测。所有石蜡标本4 μm厚连续切片，60℃烤箱烤片2 h，二甲苯、梯度酒精脱蜡、水化切片，柠檬酸盐溶液进行抗原修复(高温高压法)，3% H2O2去离子水溶液孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶。分别于切片标本上滴加兔抗CCR9单克隆抗体(稀释浓度为1 ∶50)、即用型鼠抗VEGF单克隆抗体、即用型兔抗MMP2多克隆抗体、即用型兔抗MMP9单克隆抗体，以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作为阴性对照。4℃冰箱中孵育过夜，室温下复温45 min，PBS浸洗3次，每次5 min。依次滴加PV-9000试剂盒中试剂1(聚合物辅助剂)、试剂2(辣根酶标记羊抗兔或小鼠IgG多聚体)，37℃水浴箱中45 min后取出，常规DAB显色，苏木素复染，梯度酒精、二甲苯脱水透明，中性树胶封片，镜下阅片。

1.4 结果判定 采取双盲法经由两位病理医师阅片，CCR9、VEGF、MMP2、MMP9的阳性反应定位在肿瘤细胞的胞膜和(或)胞质中，结果评判标准参考钟永泷等[10]使用的标准，采用半定量二次计分法。在400倍镜下随机挑选5个不重复视野，每个视野下计数100个肿瘤细胞，将5个视野的肿瘤细胞平均阳性率作为该切片的阳性率。阳性率≤5%记为0分；阳性率>5%～<25%记为1分；阳性率25%～<50%记为2分；阳性率≥50%记为3分。根据细胞染色的强度分为：细胞未着色为0分；细胞着浅黄色为1分；细胞着黄色为2分；细胞着棕黄色或褐色为3分。两者相乘，乘积0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～6分为阳性，>6分为强阳性；得分为0记为阴性，得分>0均记为阳性组。

1.5 统计学分析 使用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验，CCR9与VEGF、MMP2及MMP9之间的相关性分析采用双向有序列联表资料的χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9蛋白在NSCLC组织及癌旁组织的表达 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9主要在肿瘤组织细胞膜和(或)细胞质中表达，胞膜呈现黄色颗粒状，胞质呈现弥漫性黄染；在癌旁组织肺泡上皮细胞中CCR9、VEGF、MMP2和MMP9呈阳性表达，其染色强度、阳性细胞率均显著低于癌组织，见图1。CCR9、VEGF、MMP2和MMP9在肿瘤组织中的阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

图1 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9在NSCLC肿瘤组织中的表达情况 注：A为CCR9在肺腺癌中阳性表达；B为CCR9在肺鳞癌中阳性表达；C为VEGF在肺腺癌中阳性表达；D为VEGF在肺鳞癌中阳性表达；E为MMP2在肺腺癌中阳性表达；F为MMP2在肺鳞癌中阳性表达；G为MMP9在肺腺癌中阳性表达；H为MMP9在肺鳞癌中阳性表达。

表1 CCR9、VEGF、MMP2、MMP9在NSCLC患者肿瘤 组织与癌旁组织中的阳性表达情况[n=60，(n，%)]

2.2 CCR9表达与NSCLC临床病理特征及其他蛋白表达之间的关系 腺癌、淋巴结转移、VEGF阳性表达、MMP2阳性表达、MMP9阳性表达患者的肿瘤组织CCR9阳性表达率分别高于鳞癌、无淋巴结转移、VEGF阴性表达、MMP2阴性表达、MMP9阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。而不同性别、年龄段患者肿瘤组织的CCR9阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 VEGF、MMP2及MMP9的阳性表达率与淋巴结转移及CCR9之间的关系 淋巴结转移患者肿瘤组织MMP2及MMP9的阳性表达率均高于无淋巴结转移患者(P<0.05)，见表3。此外，在存在淋巴结转移患者中，其肿瘤组织CCR9的表达与VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表达均呈正相关(r=0.339，P<0.05；r=0.257，P<0.05；r=0.530，P<0.05)。

表2 不同临床病理学特征、不同VEGF、MMP2、MMP9 表达情况患者肿瘤组织中CCR9的阳性表达率比较

表3 有无淋巴结转移患者肿瘤组织VEGF、MMP2、MMP9的阳性表达比较(n，%)

3 讨 论

CCR是一类含有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体，已有研究表明，其通过与配体结合的方式其在肿瘤的发生、发展过程中发挥着举足轻重的作用[11-12]。目前越来越多的CCR被发现与肿瘤存在着密切的关系，如CCR10[13]、CCR6[14]、CXCR4[15]等。随着对CCR方面研究的深入，作为CCR家族一员的CCR9因能通过结合特异性配体C-C趋化因子配体25[16]在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等[4，7，17-20]多种肿瘤中异常表达而引起了研究者的重视。

在本研究中，我们通过检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织CCR9的表达情况发现，CCR9在肿瘤组织中的阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)，且淋巴结转移患者肿瘤组织CCR9的阳性表达率高于无淋巴结转移患者(P<0.05)，提示NSCLC组织中CCR9的表达上调，且可能与淋巴结转移密切相关，这与李杰等[21]在胰腺癌方面的报告相似。CCR9在肺腺癌和肺鳞癌中均有表达，但腺癌中的表达率更高(P<0.05)，这种差异可能可解释肺腺癌较肺鳞癌预后更差、更易早期转移的特点。因此CCR9的表达情况可作为临床评估NSCLC患者预后的有效指标，为NSCLC患者的早期诊断、预后评估等提供参考，针对CCR9的靶向治疗或许能成为NSCLC治疗方案的选择之一。

VEGF又称为血管通透因子，其首先在牛垂体滤泡星形细胞的体外培养液中提取获到，该因子能直接或间接促进血管的形成。其既能通过特异性诱导血管内皮细胞有丝分裂的方式来直接刺激血管生成[22]，又能增加血管的通透性为血管的形成提供支持。本研究结果显示，NSCLC患者肿瘤组织的VEGF阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)，这提示VEGF可能参与NSCLC的血管形成等过程，我们猜测VEGF可能促进肿瘤组织中血管的增殖从而为肿瘤细胞的生长提供营养支持。

自1962年Gross等[23]首次发现以来，目前至少已发现MMP有23个成员[24]，它们都属于锌离子依赖蛋白内切酶家族，是人体内降解细胞外基质的主要酶类，具有促进恶性肿瘤细胞侵袭和转移的作用。其中MMP2(又称为72 KD Ⅵ型胶原酶或明胶酶A)和MMP9(又称为92 KD Ⅵ型胶原酶或明胶酶B)被认为是肿瘤侵袭转移过程中最直接、最主要的金属蛋白酶[25]。MMP2和MMP9在肿瘤组织中的阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)，提示NSCLC组织中MMP2和MMP9的表达均上调。肿瘤细胞会分泌酶原状态的MMP2、MMP9，两者被激活成胶原酶以后才会降解细胞外基质，然后肿瘤细胞即可透过缺失部分向周围组织和器官进行扩散，最终达到侵袭转移的目的；而在正常组织中的MMP与基质金属蛋白酶组织抑制剂之间保持相对平衡状态，共同维持着细胞外基质的降解或聚集，维持机体的稳定。此外，淋巴结转移NSCLC患者肿瘤组织的MMP2及MMP9阳性表达率均显著高于无淋巴结转移患者(P<0.05)，也进一步提示MMP2和MMP9在NSCLC的侵袭转移中起着不可忽视的作用。

在针对CCR9与VEGF、MMP2、MMP9之间关系的研究中发现，VEGF阳性表达、MMP2阳性表达、MMP9阳性表达患者的肿瘤组织CCR9阳性表达率分别高于VEGF阴性表达、MMP2阴性表达、MMP9阴性表达患者(P<0.05)，且在淋巴结转移患者中，其肿瘤组织CCR9的表达与VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表达均呈正相关(P<0.05)，这提示CCR9有可能通过某些信号通路来调节VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表达，进而达到调节NSCLC增殖、侵袭、转移等过程。

综上所述，CCR9、VEGF、MMP2、MMP9蛋白的高表达可能在非小细胞肺癌的发生发展、侵袭转移中发挥重要作用，CCR9可能通过某些信号通路来调控VEGF、MMP2、MMP9蛋白的表达，其可能会成为评估NSCLC病情发展的重要指标。虽然目前关于CCR9在NSCLC中的研究越来越多，但是具体的调控机制及信号通路尚未阐述清楚，还需要进一步深入研究，以期能为NSCLC的临床综合治疗提供一种新的思路。

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metalloproteinase 2 and 9 in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance

WANGZhi-wei1,NIUYu-xu1,LINHui2

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the expressions of chemokine receptor 9(CCR9),vascular endothelial growth factor(VEGF),matrix metalloproteinase(MMP)2 and MMP9 in the non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues and its clinical significance.Methods The expressions of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 were detected by immunohistochemistry(PV-9000) in tumor tissues and paracarcinoma tissues of 60 patients with NSCLC.The relationship of CCR9 expression in tumor tissues with clinicopathological features and other proteins expressions was analyzed.The relationship of positive rates of VEGF,MMP2 and MMP9 with lymph node metastasis was also analyzed.Results The positive expression rates of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 in tumor tissues were higher than those in paracarcinoma tissues(P<0.05).The positive expression rates of CCR9 in tumor tissues of the patients with adenocarcinoma and with lymph node metastasis were higher than those of the patients with squamous cell carcinoma and without lymph node metastasis respectively(P<0.05).The positive expression rates of MMP2 and MMP9 in tumor tissues of the patients with lymph node metastasis were higher than those of the patients without lymph node metastasis(P<0.05).The positive expression rates of CCR9 in tumor tissues of the patients with positive VEGF expression,positive MMP2 expression and positive MMP9 expression were higher than those of the patients with negative VEGF expression,negative MMP2 expression and negative MMP9 expression respectively(P<0.05).And among the patients with lymph node metastasis,the expression of CCR9 in tumor tissues positively correlated with the expression of VEGF,MMP2 or MMP9(P<0.05).Conclusion Up-regulation of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 expressions probably plays an important role in the progression,metastasis and invasion of NSCLC.The expressions of VEGF,MMP2 and MMP9 may be regulated by CCR9 through some signal pathways.CCR9 probably becomes an important indicator for evaluating the development of NSCLC. 【Key words】 Lung neoplasm,Non-small cell lung cancer,Chemokine receptor 9,Vascular endothelial growth factor,Matrix metalloproteinase

王志维(1962～)，男，博士，教授，主任医师，研究方向：心脏大血管疾病的防治。

林辉(1957～)，男，博士，主任医师，研究方向：胸心疾病临床诊断的研究，E-mail：linhui33622@126.com。

R 734.2

A

0253-4304(2016)10-1377-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.11

2016-06-03

2016-07-25)