普萘诺尔对血管内皮细胞增殖和凋亡影响的体外实验

张定涛，何辉霞，羊书勇，吴 坡，蒋 佶，郑维银

普萘诺尔对血管内皮细胞增殖和凋亡影响的体外实验

张定涛，何辉霞，羊书勇，吴 坡，蒋 佶，郑维银

目的观察不同浓度的普萘诺尔对人血管内皮细胞的增殖和凋亡的影响,为普萘诺尔治疗血管瘤的机制研究提供依据。方法 取体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECS），胰酶消化后制成单细胞悬液，常规培养，在达对数生长期时，加入不同浓度的普萘诺尔干预，24 h后采用MTT法检测各组细胞的增殖率，流式细胞仪Annexin V-FI双染法检测细胞凋亡率。结果 作用24 h后，128 μg/ml以上浓度的普萘诺尔明显抑制人血管内皮细胞的增殖，而且能够明显增加血管内皮细胞的凋亡。结论 普萘诺尔对人血管内皮细胞的增殖有抑制作用，并能够诱导人血管内皮细胞凋亡。

普萘诺尔；血管内皮细胞；细胞增殖；凋亡；抑制

血管瘤是婴幼儿期最常见的良性肿瘤，是由血管内皮细胞异常增殖导致的。血管瘤好发于面颈部，可能影响面部器官功能及外观，甚至危及生命。偶然发现的β受体阻断剂普萘洛尔可以治疗血管瘤，于2008年首次被报道[1]，使口服普萘洛尔成为治疗血管瘤的一种新方法。这种方法疗效确切，患者耐受较好，但对其治疗机制不甚明确。本研究采用体外实验，通过观察普萘洛尔对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECS）增殖及凋亡的影响，探讨了普萘洛尔治疗血管瘤的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HUVECS细胞株，购自武汉大学典型物种保存中心；盐酸普萘洛尔，购自华中药业股份有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京碧云天公司；流式细胞仪(CyFlow RML型)购自德国PAR TEC公司。

1.2 实验方法 将液氮中冻存HUVECS细胞解冻复苏后，加入适量的培养基,1000 r/min离心5 min，弃去上清液，再次加入培养基，调整细胞浓度至1× 105个/cm3后，将细胞接种于培养板中，传代培养至第3代，调整细胞密度为2×105个/cm3，分装至培养板，实验组加入不同浓度普萘洛尔 （32、64、128和256 μg/ml），每组3个复孔，对照组不加药物只加细胞及培养液，继续培养24 h。

1.2.1 MTT法检测HUVECS抑制率 各组细胞继续培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μl，继续培养4 h；吸出孔内培养液，每孔加入DMSO 200 μl(0.5 g/L），于室温下振荡10 min。酶标仪检测波长490 nm处的每孔吸光度(OD值）。空白孔仅加培养液，绘制HUVECS生长曲线，计算普萘洛尔对HUVECS的抑制率。

1.2.2 流式细胞仪检测HUVECS凋亡率 取对数生长期的HUVECS细胞，接种于6孔板，加入2 ml 含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养24 h，达对数生长期后，再用不含血清的培养基饥饿培养，使细胞同步化到达G0期，更换培养基并加入普萘洛尔共2 ml，使药物浓度为32、64、128和256 μg/ml。药物作用细胞24 h后，吸出至2个1.5 ml的EP管中，各用1 ml PBS洗涤贴壁细胞2次，加入胰酶消化，200 μl PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/ml; 取100 μl细胞至5 ml管，加入200 μl annexin-VFITC；20～25℃水浴箱中避光孵育30 min后,加入10 μl碘化丙啶染色液（PI）混匀，加入1 ml PBS，随即进行流式细胞术检测HUVECS凋亡率。

1.3 统计学方法 采用 SPSS19.0软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 普萘洛尔对体外培养HUVECS形态的影响普萘洛尔作用于HUVECS 24 h后，倒置显微镜下观察，部分细胞梭形变为不规则，细胞间隙增大，细胞黏附力降低，可见核分裂相及细胞碎片（图1）。

图1 普萘洛尔对HUVECS形态的影响（×100）

2.2 普萘洛尔对HUVECS生长的抑制率 从表1可见，随着普萘洛尔浓度的提高，对HUVECS生长的抑制率逐渐增高。当浓度＞128 μg/ml时，对HUVECS增殖抑制作用明显，抑制率与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 普萘洛尔诱导HUVECS凋亡的检测结果随着普萘洛尔浓度升高，HUVECS凋亡率增加，普萘洛尔浓度达到128 μg/ml后，早期凋亡细胞和凋亡细胞总数计数中，实验组与对照组比较均有明显差异(P＜0.05，图2、表2)。

图2 普萘洛尔诱导HUVECS凋亡流式细胞术检测结果

3 讨论

作为婴幼儿期常见的良性肿瘤，婴幼儿血管瘤（infantile hemangiomas，IH）60%发生在面颈部[2]，它是由血管内皮细胞异常增殖引起，临床可分为增殖期、消退期和消退后期。虽然IH大都可以自然消退，因好发于面颈部，影响患儿容貌；如位于眼部、呼吸道的IH，可能会引起器官的功能障碍（如弱视、呼吸受阻）；同时常伴发溃疡、出血等。虽然可以自然消退，但部分会遗留有色素异常、皮肤皱缩等并发症，故目前学者多建议在增殖期行早期干预治疗[2]。Leaute-Labreze等[1]于无意中发现β受体阻滞剂普萘洛尔可用于婴幼儿血管瘤治疗,随后立即得到了推广并取得了良好的效果[3-4]，并建议将普萘诺尔取代皮质类固醇激素成为IH治疗一线药物[1,5]。虽然目前有大量文献报道了普萘诺尔对IH的良好临床治疗结果，但对于其治疗机制仍知之甚少。

为探讨普萘诺尔对血管瘤的作用机制，本研究检测了普萘诺尔体外对血管内皮细胞凋亡和增殖的影响，通过对体外HUVECS的培养，并以MTT实验观察了普萘诺尔对HUVECS增殖的作用，发现128 μg/ml以上浓度对HUVECS的增殖有明显的抑制作用。流式细胞仪检测的结果显示，随着普萘诺尔浓度的增加，HUVECS凋亡率逐渐提高，早期凋亡率和晚期凋亡率均逐渐增高，128 μg/ml以上浓度与对照组比较有明显促进凋亡作用，呈现出剂量依赖效应。

普萘诺尔可能是通过下调VEGF的mRNA表达，减低血管内皮细胞的VEGF表达，从而抑制HUVECS增殖和分化[6-7]。血管内皮细胞可以表达β肾上腺素能受体，刺激血管内皮细胞增殖[8]，而β受体阻滞剂普萘诺尔则可以拮抗β肾上腺素能受体，阻止细胞增殖。另有体外实验证实，普萘诺尔可以通过影响有丝分裂原激活蛋白激酶MAPK和蛋白激酶A（PKA）/花生四烯酸（AA）细胞信号通路，诱导细胞凋亡[6]。又有学者认为，普萘诺尔在下调VEGF的合成同时，还可促进血管内皮细胞脂肪化，而不是促进其凋亡[9]。

由此可见，普萘诺尔治疗血管瘤的机制和对血管内皮细胞的影响还不是十分清楚，尚需进一步研究。

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Effects of propranolol on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells in vitro

Zhang Dingtao,He Huixia,Yang Shuyong,Wu Po,Jiang Ji,Zheng Weiyin Department of Stomatology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

ObjectiveTo explore the effects of propranolol in different concentrations on the proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cell in vitro in order to provide reference for the research on the mechanism of the treatment on hemangioma with propranolol.MethodsUnfrozen HUVECSs were cultured in vitro and made into unicell suspension after trypsinization.After conventional culture,different concentration of propranolol was added for the intervention when the culture had reached the logarithmic phase.24 h later,the growth rates of the cells were detected by MTT,and the apoptosis rates were tested by flow cytometry instrument Annexin V-FI.ResultsAfter the cells were treated for 24 h,propranolol with the concentration of 128 μg/ml and above could significantly inhibite the proliferation of the HUVECSs and increase the apoptosis.ConclusionPropranolol can effectively inhibit the proliferation of human vascular endothelial cells and promote the apoptosis．

propranolol;vascular endothelial cell;cell proliferation;apoptosis;inhibition

R 732.2

A

1004-0188（2016）04-0370-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.04.008

2016-01-07）

610083成都,成都军区总医院口腔科

郑维银，E-mail:weiyinzheng@hotmail.com