双歧杆菌对雏鸡肠道杯状细胞数量及黏蛋白2含量的影响

张美曦， 隋 欣，2， 刘超男， 吕晓萍， 郑世民， 高雪丽

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省鸡西市动物疫病预防与控制中心， 黑龙江鸡西158200)

双歧杆菌对雏鸡肠道杯状细胞数量及黏蛋白2含量的影响

张美曦1， 隋 欣1，2， 刘超男1， 吕晓萍1， 郑世民1， 高雪丽1

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省鸡西市动物疫病预防与控制中心， 黑龙江鸡西158200)

本试验应用过碘酸雪夫染色法、荧光定量PCR、间接酶联免疫吸附试验对饲喂双歧杆菌后雏鸡肠道杯状细胞数量、MUC2 mRNA表达量及肠液黏蛋白2(MUC2)含量变化进行研究，揭示双歧杆菌对雏鸡局部黏膜免疫的影响。结果发现，饲喂双歧杆菌后1～18 d雏鸡肠道杯状细胞数量、MUC2 mRNA表达量及肠液MUC2含量不同程度高于对照雏鸡。其中，回肠杯状细胞数量、MUC2 mRNA及肠液MUC2含量于饲喂后1～4 d明显高于对照雏鸡(P<0.05或P<0.01)；结直肠MUC2 mRNA于饲喂后1～7 d极显著高于对照雏鸡(P<0.01)。结果表明，双歧杆菌能增加雏鸡肠道杯状细胞数量，提高MUC2的分泌量，增强雏鸡肠道黏膜免疫功能。

双歧杆菌； 雏鸡； 肠道； 杯状细胞； 黏蛋白2

双歧杆菌(Bifidobacterium)是动物肠道的优势菌群之一，经大量研究发现：该菌有提高机体免疫力、调节肠道菌群、抗肿瘤、降胆固醇等作用，且凭借无毒、无害、无残留、无污染等优势，现已用作饲料添加剂服务于畜牧业。王雪飞[1]研究发现，苦豆籽粕-双歧杆菌合生元可以提高肉仔鸡免疫器官指数、血清IFN-γ含量及NK细胞活性，从而增强肉仔鸡的免疫功能；邱春雷[2]等发现，双歧杆菌活菌制剂治疗溃疡性结肠炎疗效显著。黏蛋白2(Mucin 2)是肠道杯状细胞分泌的一种黏蛋白[3]，是肠道黏液的主要成分，有润滑肠道、抵抗机械性破坏及防止肠内有害物质侵袭等作用，在肠道黏膜免疫中发挥重要作用。目前，对双歧杆菌的研究主要集中在肠道的分布及营养作用，而对其能否通过增加肠道杯状细胞数量及MUC2表达量，加强雏鸡局部黏膜免疫功能没有较系统的研究。本试验通过对饲喂双歧杆菌后雏鸡肠道杯状细胞数量及MUC2含量的动态变化进行研究，旨在探讨双歧杆菌提高雏鸡肠道黏膜免疫的机制，为双歧杆菌在禽业中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄海蓝白雏鸡50只，雌雄各半，购自哈尔滨某孵化场。经鸡马立克病、鸡传染性腔上囊病、鸡传染性喉气管炎和鸡新城疫等抗体检测，结果均呈阴性。

1.2 菌种 双歧杆菌BB-12，购自丹麦科汉森有限公司。

1.3 主要试剂 高碘酸，碱性品红，偏重亚硫酸钠，甲基绿，活性炭；Oligo(dT)15，北京天根生物科技有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase，美国Promega公司；SYBR®Premix ExTaqT-MII，东洋纺(上海)生物科技有限公司；MUC2酶联免疫分析试剂盒，上海瑞齐生物科技有限公司。

1.4 实验动物分组及处理 将50只雏鸡随机分为对照组(简称C组)、双歧杆菌组(简称B组)，其中，C组雏鸡每日灌服一定剂量的空微胶囊，1次/d，连续灌服3 d；B组雏鸡每日灌服一定剂量的双歧杆菌微胶囊，1次/d，每次4×109CFU/mL，连续灌服3 d。两组雏鸡分别于灌服微胶囊3 d后第1、4、7、10、18天随机抽取5只，心脏采血处死，快速采取回肠、盲肠、结直肠及相应肠段的肠液，低温保存，备检。1.5 肠道杯状细胞统计 对雏鸡肠道组织进行过碘酸雪夫染色(PAS染色)，观察红色深染的杯状细胞，统计6个肠绒毛上的杯状细胞。计数时选取的绒毛大小应基本一致。

1.6 肠组织MUC2 mRNA表达量测定 应用本实验室已建立的雏鸡MUC2 mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法[4]检测肠组织MUC2 mRNA表达量。

1.7 肠液MUC2含量测定 按照MUC2酶联免疫分析试剂盒提供方法检测肠液MUC2含量。

1.8 数据处理 数据统计，用SPSS20.0软件进行数据处理，得出结论。

2 结果

2.1 肠道杯状细胞数量变化 应用双歧杆菌后1～18 d，雏鸡肠道杯状细胞数量不同程度高于对照雏鸡。回肠杯状细胞数量于1～4 d显著高于对照雏鸡(P<0.05)；结直肠杯状细胞数量于第1天显著高于对照雏鸡(P<0.05)；盲肠杯状细胞数量高于对照雏鸡，但无统计学差异。如图1,2(见中插彩版)。

图1 应用双歧杆菌后雏鸡肠道杯状细胞数量变化

*：有显著性差异；**：有极显著性差异；无*号：无显著性差异，下表同

2.2 肠组织MUC2 mRNA表达变化 应用双歧杆菌后1～18 d，肠道MUC2 mRNA表达不同程度的高于对照雏鸡。其中，回肠MUC2 mRNA于1～4 d显著高于对照雏鸡(P<0.01或P<0.05)；盲肠MUC2 mRNA于第1天显著高于对照雏鸡(P<0.05)；结直肠MUC2 mRNA于1～7 d极显著高于对照雏鸡(P<0.01)。如图3。

2.3 肠液MUC2含量变化 应用双歧杆菌后1～18 d，雏鸡肠液MUC2含量不同程度高于对照雏鸡。其中，回肠肠液MUC2含量于1～4 d显著高于对照雏鸡(P<0.05或P<0.01)；结直肠肠液MUC2含量于第1天显著高于对照雏鸡(P<0.05)；盲肠肠液MUC2含量高于对照雏鸡，但无统计学差异。如图4。

图3 应用双歧杆菌后肠组织MUC 2 mRNA表达变化

图4 应用双歧杆菌后雏鸡肠液MUC 2含量变化

3 讨论

动物消化道黏膜面积较大，不仅是消化吸收的重要场所，也是体内最大的外周免疫组织，是黏膜免疫系统重要组成部分。研究表明，禽类95%以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵，因此增强禽类局部黏膜免疫功能具有重要意义[5]。正常情况下，双歧杆菌是肠道正常菌群中的优势菌群，可以通过占位作用、营养竞争以及分泌代谢产物和细菌素抑制病原菌生长，维持肠道菌群平衡，增强机体免疫功能[6]。肠上皮细胞、肠道内的微生物群落及肠道黏液在肠道内壁形成一层保护膜，在局部黏膜免疫中发挥重要作用，其中肠道黏液的主要成分是MUC2。

MUC2是肠道杯状细胞分泌的一种分泌型黏蛋白。Juxing Chen[7]等发现，在肠屏障功能受损的肉鸡体内MUC2表达量降低；Chao[8]等研究表明，MUC2在黏液性结直肠癌的表达与局部浸润和转移有关。这些研究表明，MUC2不仅与肠道的屏障作用相关，与肿瘤发生也密切相关。本试验通过检测饲喂双歧杆菌后雏鸡肠道杯状细胞数量及MUC2含量的变化，探讨双歧杆菌对雏鸡肠道的营养作用及其对MUC2分泌的影响。

3.1 双歧杆菌对雏鸡肠道杯状细胞数量的影响 双歧杆菌可合成多种消化酶和维生素，促进氨基酸、脂类和维生素的代谢，促进蛋白吸收；双歧杆菌产酸可使环境pH值下降，有利于二价铁、维生素D及钙的吸收。本试验发现，雏鸡饲喂双歧杆菌后1～18 d，肠道杯状细胞数量不同程度高于对照雏鸡，回肠及结直肠杯状细胞数量分别于1～4 d、第1天明显高于对照雏鸡(P<0.05)。证明双歧杆菌可提高雏鸡肠道杯状细胞数量。王文利[9]等研究发现，益生菌可以使肉鸡小肠绒毛增长，隐窝加深，黏膜增厚，通过改善小肠黏膜的结构增强小肠的消化功能；刘克琳[10]等研究发现，应用益生菌生态制剂后，鲤鱼前肠黏膜褶皱增多，微绒毛长而密，肠吸收面积增大，同时益生菌生态制剂也可促进鲤鱼生长，增强免疫。以上试验结果均证明益生菌可以改善肠黏膜的结构并使机体向有益的方向发展。本试验证实，双歧杆菌可使雏鸡肠道杯状细胞数量增加。

3.2 双歧杆菌对雏鸡肠道MUC2分泌量的影响 MUC2对肠黏膜有直接保护作用，当其质和量发生变化时，肠道屏障功能受损，通透性增高，肠腔内抗原、内毒素等促炎症物质进入肠黏膜固有层，诱发免疫反应[11]。试验发现，雏鸡应用双歧杆菌后1～18 d，肠道MUC2含量不同程度高于对照雏鸡。其中，肠道MUC2 mRNA表达量于饲喂双歧杆菌后1～4 d、1 d及1～7 d显著高于对照雏鸡(P<0.01或P<0.05)；回肠肠液MUC2含量于饲喂双歧杆菌后1～4 d显著高于对照雏鸡(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明，饲喂双歧杆菌后，雏鸡肠道MUC2分泌量增加，机体局部免疫功能增强。双歧杆菌在雏鸡肠道内定植后，当其增殖到一定数量时，可以通过激活巨噬细胞，活化自然杀伤细胞和提高免疫球蛋白(特别是IgA)的水平，增强机体非特异性和特异性免疫[12]。

肠道杯状细胞分泌受多种因素影响，如肠道激素水平，肠道内源及外源性物质等。Stanley C M[13]在人大肠癌HT29-18N2细胞系检测缓激肽对糖蛋白合成和黏液素分泌的调节，证实缓激肽可增加黏液素释放；Kim S等[14]发现，杯状细胞黏液素的分泌与表皮生长因子受体(EGFR)的表达和活化有关；崔宏伟[15]等研究发现，饲喂乳酸杆菌可以增加雏鸡肠道MUC2含量。以上研究均表明杯状细胞分泌受多种因素的影响，益生菌能够诱导MUC2的分泌以及上调基因表达，拮抗致病菌的肠道粘附、侵袭以及易位作用。

4 结论

双歧杆菌通过增加雏鸡肠道杯状细胞数量，上调肠道组织MUC2mRNA的表达量及肠液中MUC2含量，提高肠道黏膜免疫，增强机体抵抗致病菌的能力。

[1] 王雪飞.苦豆籽粕—双歧杆菌合生元对AA+肉仔鸡免疫功能影响的研究[D].呼和浩特：内蒙古大学，2010.

[2] 邱春雷，严红，吴雄健，等.溃疡性结肠炎的微生态学改变及双歧杆菌的治疗作用的研究[J].中国全科医学，2014,17(26)：3077-3082.

[3] 李娟，吴丽华，石岩，等.MUC1，MUC2和MUC3在胃增生性息肉中的表达模式[J].世界华人消化杂志，2011,19(35)：3591-3596.

[4] 隋欣，高雪丽，郑世民，等.鸡MUC2mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法建立[J].中国家禽，2013,35(21)：13-16.

[5] 沙永刚，程国富，邵华斌．家禽黏膜免疫研究进展[J]．湖北农业科学，2003(3)：87-89．

[6] 袁晓丹，龙淼.鸡肠道菌群平衡的影响因素及其调控[J]畜牧与饲料科学，2015,36(11)：27-30.

[7] J uxing Chen，Guillermo Tellez，James D.Richards，etal．Identification of potential biomarkers for gut barrier failure in broiler chickens[J]．Frontiers in Veterinary Science，2015,5:1-10．

[8] Chao M,Dahiya R,Choi S R,etal.Mucins secreted by cell lines derived from colorectal mucinous carcinoma and adenocarcinoma[J]．Eur J Cancer,1997,33(6):931-941．

[9] 王文利，张玉仙，陈耀星，等.不同浓度的禽源益生素对42日龄肉鸡小肠黏膜结构的影响[C]//第四届京津冀一体化畜牧兽医科技创新研讨会暨“瑞普杯”新思想、新方法、新观点论坛，石家庄：北京市畜牧兽医学会等.2014.

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[11] Mizoguchi A，Mizoguchi E．Inflammatory bowel disease，past，present and future：lessons from animal models [J]．J Gastroenterol，2008，43(1)：1-17．

[12] 胡帅尔，陈壁峰，李文立，等.益生菌对小鼠特异性及非特异性免疫功能的影响[J].公共卫生与预防医学，2010,21(4)：11-14.

[13] Stanley C M，Phillipe T E.Brdykinin modulates mucin secretion but not synthesis from an intestinal goblet cell line[J]．Agents Actions，1994，42(3-4)：141.

[14] Kim S，Nadel J A.Role of neutrophils in mucus hypersecretion in COPD and implications for therapy[J]．Treat Respir Med，2004，3(3)：147-159.

[15] 崔宏伟，隋欣，吕晓萍，等．乳酸杆菌LA-5对雏鸡肠道黏蛋白MUC2含量的影响[J].中国家禽，2015,37(12)：22-25.

Effects of Bifidobacterium to the number of goblet cells and the content of MUC2 in intestinal tract of chicks

ZHANG Mei-xi1， SUI Xin1,2， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1， GAO Xue-li1

(1.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China； 2.Center of Anima Disease Control and Prevention of Jixi City，Jixi 158200，China)

In order to study the effects of Bifidobacterium on local mucosal immune,periodic acid-schiff staining,quantitative real-time PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay were used to study the number of goblet cells,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus after administrated Bifidobacterium.The results were as follows：the number of goblet cells of chicks’ intestinal tarct,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus in chicks administrated with Bifidobacterium were significantly enhanced when compared with those in the control group.Meantime,the number of goblet cells of ileum intestinal tract,the impression of MUC2mRNA of ileum intestinal tract and the content of MUC2 in ileum intestinal mucus were also significantly higher than those in the control group at 1-4 days after administrated Bifidobacterium (P<0.05orP<0.01); the impression of MUC2mRNA of colon intestinal tarct is extremely significantly higher than the control group in 1-7 days after administrated Bifidobacterium (P<0.01).The results showed that Bifidobacterium can enhance the number of goblet cells and affect the seretion of MUC2,each of which can enhance chicks’ intestinal mucosal immune function.

Bifidobacterium；chick；intestinal tarct；goblet cell；MUC2

GAO Xue-Li

2016-04-13

国家自然科学基金项目(31972162)

张美曦(1991-)，女，硕士生，研究方向为动物病理生理学，E-mail：zhangmercy@163.com

高雪丽，E-mail：gaoxueli@neau.edu.cn

S852.33

A

0529-6005(2016)12-0024-04