山东地区水貂肠炎病毒VP2基因的克隆和测序分析

陈 童， 杨瑞梅， 单 虎

(青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室， 山东青岛266109)

山东地区水貂肠炎病毒VP2基因的克隆和测序分析

陈 童， 杨瑞梅， 单 虎

(青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室， 山东青岛266109)

本研究对潍坊、烟台、威海和青岛地区的疑似水貂病毒性肠炎病毒(MEV)粪便样品进行检测，并在9份样品QD1309、QD1407、WH1407、WH1408、WH1508、WH1509、WF1310、WF1408、YT1408中扩增出VP2基因，和GenBank上已经公布的4株MEV参考株的VP2基因进行序列分析，结果显示，13份MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性，分别为97.5%～99.8%和96.9%～99.7%。系统发育进化树表明，QD1309、YT1408、MEV-Beregovoj-Bincentr(MEV-BB)、MEV-e属于同一个组群，不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换。本研究对水貂细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP2的编码蛋白进行遗传变异分析，为更好地预防和控制貂源细小病毒提供基础。

水貂肠炎病毒； VP2基因； 遗传变异分析

水貂病毒性肠炎病毒(minkenteritisvirus，MEV)引起的主要临床症状是剧烈腹泻，肠道出血，肠内容物呈煤焦油状。MEV为单股负链DNA病毒，属于细小病毒科细小病毒属，基因组全长约为5 kb，其基因组含有2个开放阅读框，其中一个调控病毒复制的非结构蛋白NS1和NS2，另一个组呈衣壳结构蛋白VP1和VP2[1]。VP2蛋白是细小病毒的主要衣壳蛋白，其对病毒的宿主范围、组织嗜性、抗原性、血凝性等起重要作用。该蛋白中某几个甚至一个氨基酸残基的突变，都可能导致整个病毒的生物学特性发生改变[2-3]。本研究旨在初步调查山东省主要地区的MEV流行情况,系统地分析MEV VP2基因的变异状态并进行分析，以探索山东省MEV分子流行病学趋势[4]。

1 材料与方法

1.1 病料采集 病料取自潍坊、威海、烟台、青岛地区的某些水貂养殖场，临床排血便，剖检为肠内容物呈煤焦油状，小肠黏膜充血。

1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、dNTP、DL-2 000 DNA Marker、DL-5000 DNA Marker、pMD18-T、DH5α、EcoRⅠ、SalⅠ限制性内切酶，均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司。

1.3 样品处理 用棉棒蘸取肠内容物加入PBS缓冲液中，颠倒混匀5～8次，7 000r/min离心10 min，取上清，-70 ℃反复冻融3次。12 000r/min离心10 min，取上清。

1.4 DNA的提取 取500 μL病毒上清液，加入500 μL DNAiso Reagant，颠倒混匀6～8次，静置10 min。10 000 r/min离心10 min。取上清800 μL，加入400 μL无水乙醇，颠倒混匀6～8次，4 000 r/min离心2 min，弃上清。加入1 mL 75%乙醇，颠倒混匀6～8次，12 000 r/min离心5 min，弃上清。用吸水纸把底部的75%乙醇吸干，用20 μL ddH2O吹打混匀制备成PCR扩增的模板，-20 ℃保存备用。

1.5 MEV的PCR鉴定 参考GenBank中公布的MEV NS基因序列，利用Primer 5.0软件设计一对引物，上游引物为：5′-GTAAGCTTCCAGGAGACTTT-3′,下游引物为：5′-GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT-3′，扩增片段长度671 bp。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。PCR反应体系为25 μL：模板1.5 μL，10× ExTaqBuffer 2.5 μL,上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，ExTaq酶0.2 μL，灭菌纯水补足至25 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 变形40 s；52 ℃退火30 s。72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。经PCR扩增检测样品，同时设定阳、阴性对照，琼脂糖凝胶电泳，验证为阳性的样品扩增VP2基因全长。

1.6 VP2基因的克隆和变异分析 根据GenBank上公布的MEV VP2基因序列设计引物，上游引物为：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′，下游引物为：5′-CCGCTCGAGATATAATTTTCTAGGTGCT-3′ ，扩增片段长度为1 755 bp。PCR扩增条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s。72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸3 min。将阳性产物连接到pMD18-T载体上，转化到DH5α感受态，经PCR和双酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)鉴定后送到北京华大基因科技服务有限公司测序。使用DNAStar和Mega 5.0软件进行同源性分析及构建进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定 取5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段约为671 bp，其大小与预期相符表明检测的病毒为MEV(图1)。

图1 PCR鉴定结果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：QD1309；2：QD1407；3：WH1407；4：WH1408；5：WF1408 ；6：YT1408

2.2 VP2基因扩增和双酶切鉴定 扩增VP2基因，琼脂糖凝胶电泳出现与预期大小一致目的条带，即1 755 bp。PCR产物经胶回收、连接、转化后，菌液PCR鉴定为阳性的质粒，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定大小正确，即2 694 bp 的载体带和1 755 bp的目的条带(图2)。

图2 阳性质粒双酶切鉴定结果

M：DL-5 000 DNA Marker；1：阳性质粒双酶切鉴定结果

2.3 MEV VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分析 测序结果表明，9份样品VP2序列全长为1 755 bp，编码548个氨基酸。应用DNAStar分析软件，将其与GenBank上公布的4株国内外MEV VP2基因进行序列比较，发现13份样品MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性，分别为97.5%～99.8%和96.9%～99.7%，遗传变异率较低。见图3和图4。

2.4 MEV VP2基因进化分析 用DNAStar软件对13株MEV VP2基因绘制了系统进化树，见图5。从图上可以看出，根据系统进化树将13份MEV VP2基因分为两个组群，第1个族群以样品WH1407为代表，还包括样品WF1310、WH1508、WH1408、WH1407、WH1509、QD1407、WF1408、JL2010和MEV-vaccine(MEV-vac)。第二个族群以QD1309为代表，还包括YT1408、MEV-BB、MEV-e。其中，组群一中的9株MEV又分为两个亚群，WF1310、WH1508、WH1408、WH1407、Jl2010属于第一亚群，WH1509、QD1407、WF1408和MEV-vac属于第二亚群.

图3 MEV VP2基因核苷酸序列分析

图4 MEV VP2基因氨基酸序列分析

图5 MEV VP2基因进化树分析

2.5 9株MEV VP2蛋白的氨基酸变异分析 本研究通过对比13份MEV VP2蛋白的氨基酸序列表明，MEV VP2的第80、93、103、323、564、568位氨基酸是决定宿主范围的关键氨基酸，相对比较保守；不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换，QD1309在第5、87、279、534位分别发生了A→T、M→T、W→R、V→I替换,QD1407分别在第236、300、534位发生了S→T、I→A、V→I替换，WH1408分别在第62、101、232、236、300位发生了T→A、T→I、V→I、S→T、V→I替换，WH509和WF1408在第5位点发生了A→T替换。 WF1310分别在第62、232、236、300位点发生了T→A、V→I、S→T、I→V替换。YT1408分别在第5、87、279位发生了A→T、M→T、W→R替换。

3 讨论

通过对山东地区的9份MEV样品和国内外4份样品MEV VP2基因进行同源性分析表明，核苷酸和氨基酸具有很高的同源性，分别为97.5%～99.8%和96.9%～99.7%。说明山东地区的MEV VP2基因遗传变异率较低。山东地区的9份MEV样品和目前国内使用的疫苗毒株MEV-vac的核苷酸同源性为99.0%～99.5%，氨基酸同源性为98.6%～99.5%；通过进化树结果表明，9份MEV 样品属于两个组群，彼此都有一定的亲缘性。山东地区大部分MEV和与疫苗毒株属于同一个群组，说明分离驯化于20年以前的疫苗毒株仍然适用于目前山东地区水貂病毒性肠炎的防治。通过 13株 MEV 氨基酸序列比较分析，不同样品主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换，其中62、87、101、279、534位是在山东地区发现的新的变异位点。其中，QD1309、WH1509、WF1408、YT1408在第5位发生了A→T的替换，QD1407、WH1408、WF1310都在第236位发生了S→T的替换，是否发生生物学特性变化需要进一步研究。针对山东地区的MEV分子流行病学调查研究，对于控制该病在山东地区的流行就显得非常有必要。本研究对发现的9份MEV样和GenBank上公布的4株MEV参考株VP2基因序列进行分析对比，对山东地区MEV的变异情况有了初步了解，可为山东地区MEV的诊断及防控提供参考。

[1] Reed A P,Jones E V,Miller T J.Nucleotied sequence and genome organization of canine parvovirus[J].J Virol，1988，62(1):266-276.

[2] Schofield F W.virus enteritis in mink[J].North Am Vet,1949,30;651-654.

[3] Truyen U,Agbandje M,Parrish C R.Characterization of the feline host range and a specific epitope of feline panleukopenia virus[J].Virology,1994,200(2)：494-503.

[4] 杨玲，徐向明，殷俊,等.犬细小病毒病毒分离株 VP2基因的克隆与序列分析[J].扬州大学学报，2002，2(3)：12-13.

[5] 闫喜军，张海玲，柴秀丽,等.水貂肠炎细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J].特产研究，2011(4):1-3.

Cloning and Sequencing of VP2Gene of Mink Enteritis Parvovirus in SHAN DONG Province

CHEN Tong ， YANG Rui-mei , SHAN Hu

(Qingdao Agricultural University,Key laboratory Preventive veterinary medicine in Shandong province,Qingdao 266109,China)

We tested samples of suspected parvovirus feces in Weifang,Weihai,Yantai,and Qingdao and got 9 VP2genes from QD1309,QD1407,WH1407,WH1408,WH1508,WH1509,WF1310,WF1408,and YT1408.We compared them with 4 MEV VP2genes out or in our country from GenBank.Results showed that the 13 MEV VP2genes had high homology of nucleotide and amino acids,which were 97.5%～99.8% and 96.9%～99.7%.Phylogenetic analysis showed that QD1309,YT1408,MEV-BB,and MEV-e belonged to the same group,and the difference for different strains were mainly at the site of 5,62,87,101,232,236,279,300,and 534 amino acid.

mink enteritis virus(MEV);VP2gene; genetic variation analysis

s:SHAN Hu;YANG Rui-mei

2015-12-25

科技部科技基础性工作专项(2012FY111000)；公益性行业(农业)科研专项(201303042)；山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX07105);山东省农业重大应用技术创新课题;山东省农业科技成果转化资金项目

陈童(1983-)，男，硕士，从事预防兽医学领域研究，E-mail:1141549063@qq.com

单虎，E-mail: shanhu67@163.com; 杨瑞梅，E-mail: yrm.cc@163.com

Q78

A

0529-6005(2016)12-0028-03