改良网状纤维、丽春红组合染色用于杯状细胞染色效果的观察

丁桂龄，郑建明，刘艳芳，蒋 慧

网状纤维染色在病理诊断中的应用非常广泛，特别是在协助肿瘤诊断和鉴别诊断中有较大帮助。目前，文献报道网状纤维染色应用于杯状细胞染色少见。作者经过摸索，采用改良Gomori网状纤维-丽春红组合染色法用于显示杯状细胞效果较好，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年7月海军军医大学附属长海医院病理科送检的经外科手术切除的十二指肠标本9例，标本均经10%中性福尔马林固定后取材，行常规流程制成3 μm厚石蜡切片，75 ℃烤片20 min。

1.2 主要试剂及配制(1)0.5%高锰酸钾硫酸液：高锰酸钾0.5 g，蒸馏水95 mL，加入3%硫酸液5 mL。(2)2%草酸液：草酸2 g，蒸馏水100 mL。(3)2%硫酸铁铵液：铁明矾2 g，蒸馏水100 mL。(4)改良Gomori氨性银染液：A液，硝酸银20 g，蒸馏水200 mL；B液，氢氧化钠6 g，蒸馏水200 mL。取1个干净的烧杯置于未启动的磁力搅拌器上，先加入20 mL完全溶解的A液，再加入20 mL完全溶解的B液，此时的混合液呈棕黑色。将干净的磁珠放入烧杯内，启动磁力搅拌器的开关，再用滴管缓慢滴加氨水，直至混合溶液变清亮为止，关闭磁力搅拌器，用蒸馏水将烧杯内液体补足至200 mL。配好的改良Gomori氨性银染液装入棕色试剂瓶中，也可分装为多份保存，置于4 ℃ 冰箱保存备用。(5)0.2%氯化金：氯化金0.2 g，蒸馏水100 mL。(6)丽春红苦味酸染色液[1]: 0.5%丽春红S水溶液10 mL，苦味酸饱和水溶液90 mL。

1.3 染色方法组织切片经脱蜡至水，0.5%高锰酸钾硫酸液氧化5 min，自来水洗。2%草酸液漂白1 min，自来水洗。2%硫酸铁铵液染1 min，蒸馏水洗。改良Gomori氨性银染液滴染2 min，蒸馏水洗。10%甲醛液2 min，自来水洗。0.2%氯化金染1 min，自来水洗。丽春红苦味酸染色液滴染3 min。直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

组织染色后可见：十二指肠黏膜分布数量不等的杯状细胞，呈黑褐色或深粉褐色；杯状细胞顶部胞质内的黏蛋白呈淡粉褐色；胶原纤维呈暗红色；三者与周围组织对比明显，组织结构层次清晰，染色鲜明，镜下易辨认(图1、2)。

图1 十二指肠杯状细胞(红箭头)呈轮廓清晰的黑褐色或深粉褐色；杯状细胞顶部胞质内的黏蛋白呈淡粉褐色(蓝箭头)；胶原纤维(黄箭头)呈暗红色、不规则弯曲状分布；十二指肠腺(黑箭头)呈粉褐色、腺状排列，四者与周围组织对比明显，组织结构层次清晰，染色鲜明、易辨认，改良网状纤维-丽春红组合染色 图2 十二指肠杯状细胞(红箭头)呈轮廓清晰、界限分明的黑褐色或深粉褐色；杯状细胞分泌的黏液(绿箭头)呈粉褐色、喷射状；杯状细胞顶部胞质内的黏蛋白呈淡粉褐色(蓝箭头)，三者染色鲜明、极易辨认，改良网状纤维-丽春红组合染色

3 讨论

杯状细胞是分布于黏膜上皮中的黏液分泌细胞，其顶部膨大，底部狭细，位于基膜上，顶部胞质内充满内含黏蛋白的黏原颗粒[2]。杯状细胞的形态及其分泌物成分的改变，常与疾病的发生、发展等相关。HE和PAS染色常用于显示杯状细胞。HE染色后的杯状细胞多呈淡染、空泡状，与其它呈空泡性变化的组织难以区分。PAS染色后的杯状细胞虽呈紫红色，但十二指肠腺也会整体着色，该染色方法着染的成分较多且不具有特异性，对比染色也不鲜明。

采用网状纤维染色显示杯状细胞的文献报道较少。本文采用改良Gomori网状纤维染色法能较好地显示杯状细胞，与其自身结构及其分泌物的成分有关。杯状细胞是一种典型的分泌黏蛋白的黏液细胞，其黏蛋白属于黏多糖类物质，是一种特殊的糖蛋白。网状纤维染色原理[3]：基于网状纤维表层包有一层特殊的糖蛋白，即酸性蛋白多糖，其与氨银络合物相互作用，后者经甲醛醛基还原为金属银，银离子沉淀于网状纤维内及其表面呈黑色。网状纤维的染色方法较多，目前最常用Gordon-Sweets和Gomori染色法，两者的原理都是基于网状纤维的嗜银性和银氨染液浸染的原理。然而经典染色法对杯状细胞的染色效果并不理想。本文采用改良Gomori网状纤维染色，既优化了Gomori氨性银染液的配制方法，又省去了2%硫代硫酸钠染色步骤，还组合了丽春红苦味酸染色液对胶原纤维进行着色。本组染色后的杯状细胞镜下观察更加直观，背景对比更加清晰。染色过程中，需特别注意以下细节：(1)高锰酸钾氧化的时间要适度，时间过短氧化不充分，时间过长组织易掉片。(2)草酸漂白时间要把握好，一旦肉眼可见组织变白，即可终止染色，否则长时间漂白组织易掉片。(3)改良Gomori氨性银染液的配制和此步骤的染色反应是关键。染液配置过程中，玻璃器皿必须干净，临用前建议再次用蒸馏水清洗器皿。A液和B液混合成C液时，建议在磁力搅拌器或其它混匀器上进行，可使后续滴加氨水使混合液变清亮的反应更易进行。滴加氨水的量要适度，否则组织着色不佳。配制好的改良Gomori氨性银染液，盛放在棕色试剂瓶中或分装成多份置于4 ℃冰箱中保存备用。滴染改良Gomori氨性银进行染色，虽然节约试剂且能较好地控制染色反应，但缺点是易形成银颗粒沉淀和一层表面银膜，故滴染时建议吸取改良Gomori氨性银染液的上清液。(4)改良Gomori氨性银染色后的蒸馏水清洗至关重要，建议将切片稍倾斜，将蒸馏水从倾斜后的切片上缘注入，待银膜浮起后再迅速用蒸馏水冲洗切片。(5)甲醛的还原时间也要严格控制，否则着色不佳。(6)省去了常规网状纤维染色中2%硫代硫酸钠染色步骤，整体染色时间缩短。(7)选用0.5%丽春红苦味酸S水溶液滴染组织，可以增强染色对比度，较好地观察杯状细胞与其周边组织形态的变化和相互关系。

综上所述，改良Gomori网状纤维染色法对于杯状细胞显示特异性强，敏感性高，定位准确，结果易于判读。