血管内皮生长因子在急性减压缺氧小鼠肺组织中的表达研究

任　俊，马慧萍，高荣敏，吴金华，蒙　萍，贾正平



血管内皮生长因子在急性减压缺氧小鼠肺组织中的表达研究

任俊，马慧萍，高荣敏，吴金华，蒙萍，贾正平

[摘要]目的研究血管内皮生长因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)在急性减压缺氧小鼠肺组织中的表达及意义。方法采用低压低氧动物实验舱分别模拟海拔6000 m和8000 m高原缺氧环境，将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、缺氧6、9、12、24、48、72 h组，每组10只。HE染色切片观察缺氧不同时间小鼠肺组织病理学的改变情况，免疫组织化学法检测肺组织VEGF的表达水平差异及其规律。结果缺氧各组肺组织肺泡间质薄厚不均，肺泡大小不一，部分肺泡腔内见少量红细胞，血管扩张充血出血，且随海拔的增加病理性状况愈严重；VEGF阳性表达强度半定量评分较正常对照组显著增加(P<0.01)，且随海拔的增加及缺氧时间的延长表达增加。结论减压缺氧能造成小鼠肺组织损伤，呈现水肿病理表现，并刺激VEGF分泌，最终加重肺水肿和诱导细胞坏死。

[关键词]血管内皮生长因子；减压缺氧；急性高原病；肺组织

缺氧是许多疾病的一个基本病理过程，与包括急性高原病在内的心血管疾病、中风等多种疾病的发生有关。高原缺氧是引起高原肺水肿的重要因素，有研究报道，在进入海拔3700 m以上高原的人群中，高原肺水肿的发病率为0.5%～2%。高原肺水肿起病急、进展快、危害大，主要是因高原缺氧引起机体肺动脉压增高、肺血容量增加、肺微循环障碍，进而导致液体渗漏至肺间质和肺泡而引起的一种高原特发病。近年来有学者研究发现，血管内皮细胞生长因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)不但能促进血管内皮细胞的生成，而且在缺氧性肺水肿形成机制中起重要作用，这些相关研究成为近年来医学研究的热点之一[1]。课题组前期研究表明急性减压缺氧能使小鼠脑、心组织中VEGF表达升高，且随着缺氧时间的延长，其表达明显增加，从而导致血管通透性增加，组织损伤也愈加明显[2]。本实验拟采用低压低氧动物实验舱建立模拟急性高原缺氧小鼠模型，观察肺组织的组织病理状态，并采用免疫组化方法检测损伤肺组织中VEGF蛋白的表达，探讨急性高原缺氧损伤后VEGF蛋白在肺组织中的变化情况。

1材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性Balb/c小鼠130只，体重18~22 g，购自兰州军区兰州总医院动物实验科，许可证编号：SYXK(军)2012-0020，饲养于兰州军区兰州总医院动物实验科。所有实验动物给予充足、洁净的饮水和食物，置于12 h昼夜循环的恒温(23℃)环境中。所有对于实验动物的操作符合相关伦理要求，已最大限度的保障实验动物的福利，避免非必要的损伤性处理。

1.2仪器与试剂FLYDWC50-IIA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州雷航空军械有限责任公司)；倒置显微镜(奥林巴斯)；高速离心机(德国Appendorf公司)；水浴锅(上海医疗器械七厂)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；TB-718E型生物组织自动包埋机(湖北泰雅电子技术有限公司)；冷冻切片机、ZT-12J1生物组织自动脱水机、生物组织摊烤片机(购于湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)；多克隆抗体Rabbit polyclonalto VEGF(购于Abcam)；抗体稀释液、SABC免疫组化试剂盒(包括二抗)、DAB显色液(购于武汉博士得生物工程有限公司)；PBS磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液(购于北京中山金桥生物技术有限公司)；所用化学试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1模拟海拔6000 m和8000 m急性高原缺氧小鼠实验：取SPF级健康雄性BALB/c小鼠130只，饲养适应3 d后按照6000 m和8000 m两种缺氧环境随机分成正常对照组，缺氧6、9、12、24、48、72 h组，每组10只。正常对照组小鼠不缺氧，分别将其余各组小鼠放入低压低氧动物实验舱模拟6000 m和8000 m海拔缺氧环境。缺氧时以10 m/s的速度升至6000 m或8000 m海拔，维持相应缺氧时间，完成缺氧后于10 min内快速下降海拔高度使舱内气压与外界大气压相同。小鼠完成缺氧处理后立即颈椎脱臼致死，并根据不同实验目的对肺组织进行相应处理。

1.3.2肺组织病理观察：各组小鼠完成缺氧处理后，取出各组小鼠的肺组织，以生理盐水洗净血液，立即浸入10%甲醛中固定。各个样本进行石蜡包埋、组织切片、染色等相应的处理，最终用显微镜观察。

1.3.3肺组织VEGF的表达：免疫组织化学处理步骤如下：①取各组肺组织标本的石蜡切片放至烘箱；②脱蜡；③加入3% H2O2灭活内源性酶；④95℃高温修复抗原；⑤加入BSA封闭液；⑥加入一抗：一抗稀释比例1︰150；⑦加入二抗；⑧加入SABC；⑨DAB显色，控制反应时间；⑩苏木素复染；封片。每张切片随机选取3个200倍高倍视野，背景为紫蓝色，参照Harsha等[1]标准，对VEGF阳性表达强度行半定量评分：细胞未着色为0分，散在细胞着色(浅黄色)为1分，弥漫性弱阳性着色(浅棕黄色)为2分，弥漫性中等强度着色(棕黄色)为3分，弥漫性强阳性着色(棕褐色)为4分。

2结果

2.1模拟海拔6000 m高原缺氧小鼠肺组织显微结构观察如图1所示，光镜下正常对照组肺泡结构正常，肺泡腔大小一致，肺泡间质清晰；与正常对照组相比，模拟海拔6000 m缺氧6 h组小鼠肺泡间质薄厚不均，肺泡大小不一；缺氧9 h组和12 h组小鼠肺泡间质增厚，部分肺泡腔内见少量红细胞，血管充血；缺氧24 h组较12 h组小鼠损伤严重，且部分肺泡腔见少许渗出液；缺氧48 h和72 h组小鼠肺间质增厚，肺泡结构不清晰，血管充血出血，肺泡腔内见红细胞及少量含铁血黄素，部分肺泡扩张。

2.2模拟海拔6000 m高原缺氧小鼠肺组织VEGF蛋白的表达VEGF在胞浆表达，阳性胞核呈蓝色，胞浆着棕黄色，颜色深浅和着色强弱表明VEGF表达水平的高低。如图2、图5所示，与正常对照组相比，模拟海拔6000 m各缺氧组小鼠肺组织胞浆着色深，着色面积增大，即VEGF表达明显增加，且随着缺氧时间的延长，VEGF表达增加更为显著。

2.3模拟海拔8000 m高原缺氧小鼠肺组织显微结构观察如图3所示，光镜下正常对照组小鼠肺泡结构正常，肺泡间质薄厚均匀清晰可见；与正常对照组相比，模拟海拔8000 m缺氧6 h组小鼠肺泡间质增厚，薄厚不均，肺泡腔大小不一；缺氧9 h组较6 h组小鼠损伤稍重，部分血管扩张充血；缺氧12 h组小鼠血管明显扩张充血出血，肺泡大小不一，部分肺泡腔内见较多红细胞及少量渗出液；缺氧24 h组较12 h组小鼠损伤稍缓和；缺氧48 h组和72 h组较24 h组小鼠病理变化显著，血管明显扩张充血出血，肺泡腔内见较多红细胞及大量渗出液。实验结果显示，模拟海拔8000 m高原缺氧环境对小鼠肺组织的损伤较海拔6000 m严重。尤其在缺氧12 h组和缺氧更长时间的小鼠中，这种损伤程度更加严重的趋势愈明显，坏死的细胞越来越多，组织结构被破坏得越来越严重。

图1　模拟海拔6000 m高原缺氧不同时间对小鼠肺组织显微结构的影响(HE×200)A.正常对照组;B.缺氧6 h组;C.缺氧9 h组;D.缺氧12 h组;E.缺氧24 h组;F缺氧48 h组;G.缺氧72 h组

图2　模拟海拔6000 m高原缺氧不同时间对小鼠肺组织血管内皮生长因子表达的影响(HE ×200)A.正常对照组;B.缺氧6 h组;C.缺氧9 h组;D.缺氧12 h组;E.缺氧24 h组;F缺氧48 h组;G.缺氧72 h组

图3　模拟海拔8000 m高原缺氧不同时间对小鼠肺组织显微结构的影响(HE ×200)A.正常对照组;B.缺氧6 h组;C.缺氧9 h组;D.缺氧12 h组;E.缺氧24 h组;F缺氧48 h组;G.缺氧72 h组

2.4模拟海拔8000 m高原缺氧小鼠肺组织VEGF蛋白的表达如图4、图5所示，与正常对照组相比，模拟海拔8000 m各缺氧组小鼠肺组织胞浆着色深，着色面积增大，即VEGF表达明显增加，且在9 h段表达显著增加，此后随时间延长，VEGF表达增加显著。实验结果显示，小鼠在模拟海拔8000 m缺氧条件下，为了应对比模拟海拔6000 m更为严重的缺氧环境，显著增加了VEGF的表达，进而加重肺部细胞所受到的损伤，导致细胞凋亡，肺泡破损。

图4　模拟海拔8000 m高原缺氧不同时间对小鼠肺组织血管内皮生长因子表达的影响(HE ×200)A.正常对照组;B.缺氧6 h组;C.缺氧9 h组;D.缺氧12 h组;E.缺氧24 h组;F缺氧48 h组;G.缺氧72 h组

图5　模拟海拔6000 m与8000 m高原缺氧不同时间对小鼠肺组织血管内皮生长因子表达的影响注：与正常对照组相比，aP<0.05，bP<0.01

3讨论

高原缺氧是引起高原肺水肿的重要因素。机体缺氧后，为了代偿需要，血管容易增生，而VEGF是促血管增生、增加血管通透性的关键因子[2]。本实验通过模拟高原急性缺氧环境，研究肺组织的形态学方面的变化，并从蛋白水平研究VEGF的变化情况。

模拟高原缺氧小鼠肺组织病理学研究发现，光镜下正常对照组小鼠肺泡结构正常，肺泡腔大小一致，肺泡间质清晰；海拔6000 m小鼠随着缺氧时间的延长损伤程度逐渐加重：6 h组肺泡间质薄厚不均，肺泡大小不一； 9 h和12 h组肺泡间质增厚，部分肺泡腔内见少量红细胞，血管充血；24 h组较12 h组严重且部分肺泡腔见少许渗出液；48 h和72 h组肺间质增厚，肺泡结构不清晰，血管充血出血，肺泡腔内见红细胞及少量含铁血黄素，部分肺泡扩张；海拔8000 m小鼠在相同缺氧时间点较6000 m小鼠的损伤程度更为明显，其中24 h组虽较12 h组稍缓和，但48 h组和72 h组水肿情况更为严重，这可能是由于在较高海拔下机体代偿性反应加重所致，具体原因有待进一步研究。本实验结果表明，缺氧会造成小鼠肺组织呈现病理性损伤，有水肿现象，且损伤程度与海拔高度及缺氧时间有关。

VEGF是血管新生和生成调节最关键的调节因子，可以强有力的促进新生血管形成，在创伤愈合、慢性炎症时的血管增生、肿瘤血管的形成等过程中发挥重要作用[3-5]。然而，作为一种促炎症因子，VEGF能够增加血管通透性[6-8]。低氧诱导VEGF生成，当机体内VEGF的水平达到一定浓度时，VEGF作用于血管内皮细胞，导致血管渗漏，促进急性高原病的恶化[9-11]。本实验结果表明，缺氧能造成小鼠肺组织损伤，呈现水肿病理表现，并刺激VEGF分泌，激发新生血管形成。缺氧后，肺组织中VEGF的表达升高，且随模拟海拔的增高及缺氧时间的延长，表达显著增加。VEGF是通过与受体的靶向结合发挥调控血管生成等功能的[12-13]。受体VEGFR-2参与调节血管内皮功能[14-15]，该受体被VEGF激活后，作用于酪氨酸激酶传导通路，诱导血管新生，促进血管内皮细胞有丝分裂[16-17]。同时，VEGF增强囊泡器的功能，提高血管通透性，从而增加纤维蛋白原等物质外渗，导致血浆渗透压降低，引起组织水肿[18-19]。

高原肺水肿是一种非心源性的肺水肿，发生在急进海拔3000 m以上的健康人群中，缺氧性肺血管扩张造成的渗漏是其发病的主要原因。VEGF对于缺氧机体来说具有双刃剑的作用，一方面，VEGF增加有利于缺氧状态下机体的代偿；另一方面，VEGF能影响血管内皮细胞，其表达增加会导致血管通透性增加，血浆外渗，导致组织呈现水肿病理性变化。VEGF适量升高，诱发新血管形成而不会引起心脑肺等器官的病理变化，有利于提高机体对高原缺氧的适应能力。因此，我们将对VEGF进行深入研究，筛选作用于VEGF的有效药物，通过调控VEGF，使其适量表达，从而应用于治疗高原肺水肿、急性高原病等疾病。

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(收稿时间：2015-09-10修回时间：2015-10-20)

肿瘤基础与临床

·论著·

VEGF Expression on Lung Tissues of Mice under Acute Depression and Hypoxia Condition

REN Jun, MA Hui-ping, GAO Rong-min, WU Jin-hua, MENG Ping, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and significance of vascular endothelial growth factor (VEGF) in lung tissues of mice under acute depression and hypoxia condition. MethodsThe hypobaric and mionectic chamber was used to simulate 6000 m and 8000 m high altitude hypoxia environment, and BALB/c mice were randomly divided into normal group (n=10), hypoxia for 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h groups (n=10 for each group). The pathological changes of lung tissues in different hypoxia times were observed using HE staining, and VEGF expressions and its rule of lung tissues were detected using immunohistochemistry method. ResultsIn hypoxia groups, the tissues between pulmonary alveoli were different thickness and sizes, and a small amount of red blood cells was observed in some pulmonary alveoli. The vascular extension, hyperemia and hemorrhage were found, and pathological changes were more serious with increasing altitude. Compared with those in normal group, the positive VEGF expression of intensity semi-quantitative scores were significantly increased in hypoxia groups (P<0.01), and VEGF expressions were increased with increasing altitude and prolonged hypoxia time. ConclusionThe lung tissues may be damaged in mice under depression and hypoxia condition, and it can induce edema and stimulate VEGF secretion, which may result in more serious pulmonary edema and cell death.

[Key words]Vascular endothelial growth factor； Depression and hypoxia； Acute mountain sickness； Lung tissues

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.002

[文献标志码][中国图书资料分类号]R341 R977.6A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0005-05

[通讯作者]马慧萍，E-mail：mahuipingcxr@yahoo.com

[基金项目][作者单位]730050 兰州，兰州军区兰州总医院药剂科全军高原环境损伤防治重点实验室